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1.大理大學(xué)，云南 大理 671000；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南 昆明 650111；4.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111

藜蘆為百合科藜蘆屬植物，以根、根莖入藥，用于治療高血壓、血吸蟲、腦出血、中風(fēng)痰壅、喉痹不通、癲癇、瘧疾、骨折、跌打損傷、疥癬和惡瘡等疾病，民間也用于癌癥的治療[1-5]。藜蘆的主要活性成分為甾體類生物堿，其中介芬胺含量較高，達(dá)生物總堿的21.28%[6-12]。介芬胺具有抗腫瘤、抑制細(xì)菌生長的作用，其可以與Hh通路上游激活因子Smo特異性結(jié)合而抑制通路信號的傳遞，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞的增值效應(yīng)；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了介芬胺對胰腺癌細(xì)胞ASPC-1、PANC-1有明顯的抑制作用[13-20]。同時(shí)，介芬胺也為毒性成分，且毒性較強(qiáng)[1,20]，主要表現(xiàn)為致畸、生殖毒性等[20-22]。

介芬胺既是藜蘆藥材中的活性成分，也是毒性成分。在藜蘆臨床應(yīng)用時(shí)，應(yīng)進(jìn)行藥物濃度監(jiān)測，防止過高的藥物濃度導(dǎo)致的毒性反應(yīng)。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚無關(guān)于人血漿中介芬胺血藥濃度測定方法的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在建立人血漿中介芬胺血藥濃度的LC-MS/MS測定方法，并對此方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，為藜蘆臨床應(yīng)用時(shí)血藥濃度測定提供可靠檢測方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Agilent 1200SL，美國Agilent公司)、三重四級桿質(zhì)譜儀(API3200 Q-Trap，美國AB公司)、臺式高速冷凍離心機(jī)(Allegra 64R，美國Beckman公司)、電子天平(DV215CD，上海 OHAUS公司)。

1.2 試劑 介芬胺(Jer)對照品(含量：98.90%，批號：SBJ150625，南京森貝伽生物科技有限公司)、非那西汀(Phe)對照品(含量：98%，批號：76747319，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司)、甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，氨水、乙酸乙酯、醋酸銨為分析純。

2 方法

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX Extend C18柱，3.5 μm，4.6 mm×50 mm (美國Agilent公司)；流動(dòng)相：A：10 mmol/L醋酸銨(氨水調(diào)PH至8.8)，B：乙腈；梯度洗脫方式：0～0.2 minV(A)∶V(B)=90∶10；0.2～2.0 minV(A)∶V(B)=10∶90；2.0～5.0 minV(A)∶V(B)=10∶90；5.1～7.5 minV(A)∶V(B)=90∶10，柱溫：20 ℃；流速：400 μL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)，掃描模式：正離子模式，檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，離子源參數(shù)：氣簾氣(CUR)：20.00 psi，噴霧電壓(IS)：5500.00 V，霧化溫度(TEM)：500.0 ℃，霧化氣(GS1)：50.0 psi，輔助氣(GS2)：50.0 psi，碰撞氣(CAD)：2500 V；介芬胺定量離子對m/z為426.2→114.1，對應(yīng)二級全掃描的質(zhì)譜圖如圖1所示；非那西汀定量離子對m/z為180.2→110.0；介芬胺檢測時(shí)的解簇電壓(DP)：75 V，射入電壓(EP)：10 V，碰撞池入口電壓(CEP)：15 V，碎裂電壓(CE)：50 V，碰撞室射出電壓(CXP)：3 V；非那西汀檢測時(shí)的DP：40 V，EP：5 V，CEP：180 V，CE：23 V，CXP：12 V。

2.2 儲備液和工作液的配制 精密稱定介芬胺對照品5.85 mg、5.30 mg 2份，用甲醇溶解并稀釋成濃度為334 μg/mL、212 μg/mL的儲備液。將濃度為334 μg/mL的儲備液用甲醇稀釋至濃度分別為 867、434、217、108、54.0、27.0、9.00 ng/mL的校正工作液，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；同法將濃度為212 μg/mL的儲備液稀釋至濃度分別為785、196、49.0 ng/mL的質(zhì)控工作液，用以制備質(zhì)控樣品；質(zhì)控樣品用于精密度、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性考察。同法配制濃度為2.59 μg/mL的非那西汀內(nèi)標(biāo)工作液。

2.3 血漿樣品的處理 取10 μL內(nèi)標(biāo)工作液至EP管中，室溫氮吹至干，加入100 μL人空白血漿，渦旋混合2 min，加入40 μL 25%氨水，漩渦混合1 min，加入1 mL乙酸乙酯，漩渦混合3 min、6000 r/min離心10 min，取出上清液600 μL，室溫氮吹至干，150 μL甲醇復(fù)溶，渦旋混合2 min、15000 r/min離心10 min，取上清待測。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 特異性 以2.1項(xiàng)下的檢測條件分別進(jìn)樣空白血漿樣品、空白血漿加標(biāo)樣品，測定，獲得提取離子流圖，見圖2。由圖可見，血漿中介芬胺、內(nèi)標(biāo)非那西汀的保留時(shí)間分別為3.73 min、3.29 min，表明血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不影響介芬胺、內(nèi)標(biāo)非那西汀的檢測。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 取10 μL內(nèi)標(biāo)工作液至已編號的2.0 mL EP管中，每管對應(yīng)加入各濃度校正工作液10 μL，室溫氮吹至干，加入100 μL空白人血漿，得血藥濃度分別為86.7、43.4、21.7、10.8、5.40、2.70 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，按2.3項(xiàng)方法處理。每濃度平行2份，進(jìn)樣測定。以檢測目標(biāo)物峰面積(Ab)和內(nèi)標(biāo)峰面積(Ah)的比值為縱坐標(biāo)Y，血藥濃度為橫坐標(biāo)X，采用加權(quán)最小二乘法擬合(權(quán)重1/X2)，結(jié)果見表1，確定定量范圍為2.70～86.7 ng/mL，定量下限為2.70 ng/mL。

表1 LC-MS/MS法測定Jer標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)

注：NA表示該項(xiàng)不適用或未計(jì)算。

3.3 殘留率 以線性最高濃度點(diǎn)樣品-空白血漿樣品順序交叉進(jìn)樣，計(jì)算空白血漿樣品中殘留峰面積與定量下限樣品峰面積比值。結(jié)果檢測目標(biāo)物殘留值不大于7.45%，內(nèi)標(biāo)殘留值不大于0.19%，表明殘留量可忽略不計(jì)。

3.4 精密度與準(zhǔn)確度 于3 d分別制備3批，每批濃度為2.70、4.90、19.6、78.5 ng/mL的血漿樣品，每濃度平行6份，按2.3項(xiàng)下方法處理、測定，計(jì)算精密度與準(zhǔn)確度,結(jié)果見表2。從表中結(jié)果可知，精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果符合生物樣品分析要求。

表2 介芬胺在人血漿中的精密度、準(zhǔn)確度 (n=6)

3.5 基質(zhì)效應(yīng) 取來源于6個(gè)不同個(gè)體的空白人血漿，參照2.3項(xiàng)下方法提取空白基質(zhì)；將不同濃度的質(zhì)控工作液加入內(nèi)標(biāo)后用甲醇配制成表3中相應(yīng)濃度，得不含基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液；用該標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶空白基質(zhì)，得到含有基質(zhì)的樣品。測定該標(biāo)準(zhǔn)溶液和含有基質(zhì)的樣品，考察方法基質(zhì)效應(yīng)。

基質(zhì)效應(yīng)MF%=(含有基質(zhì)樣品峰面積/標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積)×100%；內(nèi)標(biāo)歸一化的MF%=(目標(biāo)物的MF/內(nèi)標(biāo)的MF)×100%。結(jié)果見表3，表明基質(zhì)對介芬胺及內(nèi)標(biāo)非那西汀的影響較小，且對各濃度影響程度一致，滿足生物樣品分析檢測要求。

表3 介芬胺、非那西汀基質(zhì)效應(yīng)

3.6 穩(wěn)定性

3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液穩(wěn)定性考察 處理、測定得到介芬胺、非那西汀儲備液于2～8 ℃放置211 d后的峰面積與新鮮制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積，計(jì)算兩時(shí)間點(diǎn)相對偏差RE%值，分別為9.05%、0.05%，表明介芬胺、非那西汀儲備液于2～8 ℃至少可以放置211 d。

3.6.2 質(zhì)控樣品穩(wěn)定性考察 分別考察質(zhì)控樣品于待考察條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。表明介芬胺在血漿中于考察條件下放置均穩(wěn)定。

表4 質(zhì)控樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果 (n=6)

4 討論

4.1 流動(dòng)相選擇 在液質(zhì)方法中常常選擇在流動(dòng)相水相中加入適量濃度的揮發(fā)性緩沖鹽、弱酸及弱堿，形成緩沖體系，從而達(dá)到改善待測物的色譜行為、提高質(zhì)譜靈敏度。本方法建立過程中分別考察了0.1%甲酸水-甲醇/乙腈、超純水(氨水調(diào)pH值至8.8)-甲醇/乙腈、2 mmol/L醋酸銨-甲醇/乙腈等流動(dòng)相體系，均未出峰；但在2 mmol/L醋酸銨(氨水調(diào)pH值至8.8)-乙腈、10 mmol/L的醋酸銨(氨水調(diào)PH至8.8)-乙腈流動(dòng)相體系中均出峰且峰型良好，且目標(biāo)物在10 mmol/L的醋酸銨(氨水調(diào)pH至8.8)-乙腈流動(dòng)相體系中的響應(yīng)值為2 mmol/L醋酸銨(氨水調(diào)pH值至8.8)-乙腈體系的兩倍，故選用10 mmol/L的醋酸銨(氨水調(diào)pH至8.8)-乙腈作為流動(dòng)相。

4.2 色譜柱選擇 方法建立過程中考察了Xtimate C18，SunfireTM C18柱， ZORBAX Extend C18柱三根色譜柱。因方法中流動(dòng)相pH為8.8，與SunfireTM C18的pH最高限相近，長時(shí)間使用會(huì)嚴(yán)重影響色譜柱使用壽命；Xtimate C18分析時(shí)間長，影響檢測效率；ZORBAX Extend C18柱pH耐受為2.0～11.5，介芬胺、非那西汀保留時(shí)間分別為3.73 min、3.29 min，故選用ZORBAX Extend C18柱。

4.3 前處理方法選擇 血漿樣品前處理考察了乙腈蛋白沉淀法、乙酸乙酯提取法及固相萃取法，三種方法基質(zhì)效應(yīng)、回收率均能滿足生物樣品檢測要求。但乙腈蛋白沉淀法定量下限是乙酸乙酯提取法定量下限的2倍；固相萃取法與乙酸乙酯提取法結(jié)果相當(dāng)，但其成本較高，故選用乙酸乙酯提取法處理血漿樣品。