紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，云南 蒙自 661199

白刺花又名苦豆花、白花，為豆科小灌木植物，在南方各地的山坡、田埂及丘陵地帶均有大量分布，有的荒地上甚至成為其主要的植被分布[1]。云南多數(shù)地區(qū)有食用其花的習(xí)俗，為云南紅河州彝族、白族、苗族、哈尼族等少數(shù)民族習(xí)用[2]。白刺花具有清熱利濕、消積通便、殺蟲止癢的功效，用于腹痛腹脹、食積蟲積、痢疾；帶下陰癢；疥癩瘡癬[3]；其花有清熱解暑作用，可用于暑熱煩渴等[4]。當(dāng)?shù)匕傩沼闷渑莶栾嬘?，在降脂降糖上具有一定效果，但未?jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道白刺花有降血脂及降血糖的作用。白刺花含黃酮及生物堿，有抗炎、抗過(guò)敏的作用[5]?；诎状袒ǖ母鞣N優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，筆者欲將野生白刺花的葉、花開(kāi)發(fā)為保健速溶茶，通過(guò)試驗(yàn)研究，優(yōu)化出白刺花總黃酮的最佳提取方法，為白刺花保健速溶茶的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 A580型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(翱藝儀器有限公司) ；ML204分析天平(上海亞榮儀器有限公司)；FA2004電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司) ；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司) ；HH-4 型恒溫水浴鍋(常州潤(rùn)華電器有限公司) ；DLF-18型流水式中藥粉碎機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司) ；RE-3000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮儀器有限公司) 。

1.2 材料 蘆丁對(duì)照品(批號(hào):20160427，上海金穗生物科技有限公司) ；白刺花采自紅河州豆科小灌木植物白刺花的花；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉均為分析純，購(gòu)于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備[6]精密稱取干燥的蘆丁對(duì)照品10 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，至水浴鍋上微熱使蘆丁溶解，冷卻后，在甲醇至刻度，搖勻，即得每1 mL含蘆丁0.2 mg的對(duì)照品溶液。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取對(duì)照品溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，再加10%Al(NO3)3溶液1 mL搖勻，再放置6 min，加1 mol / L氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，于波長(zhǎng)400～600 nm 范圍內(nèi)掃描，500 nm波長(zhǎng)處有一最大吸收峰，故選擇500 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、1、2、3、4、5 mL，分別置于25 mL量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)下方法，選擇500 nm波長(zhǎng)，用相應(yīng)的試劑作空白，測(cè)定每種溶液的吸光度，以吸光度Y做橫坐標(biāo)，濃度X做縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表1及圖1。回歸方程得Y= 21.725X-0.0012，r2=0.9998，結(jié)果顯示，蘆丁在 0.008～0.04 mg/mL內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

表1 蘆丁對(duì)照品線性關(guān)系考察表

2.1.4 供試品溶液的制備 將白刺花原料粉碎，過(guò)60目篩，按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的條件進(jìn)行提取，提取液減壓抽濾，濾液定容，即得供試品溶液。

2.1.5 樣品中總黃酮的含量測(cè)定 精密量取2 mL供試品溶液置于25 mL容量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率。

式中:C 為提取總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1 為測(cè)量液定容體積，25 mL；V2為測(cè)量時(shí)量取的體積，2 mL；V3為提取液定容體積，100 mL；m為稱取樣品的質(zhì)量，5000 mg。

2.2 單因素考察

2.2.1 加液量對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響 固定乙醇濃度60%，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度 80 ℃ 等實(shí)驗(yàn)因素，考查5、10、15、20、25倍加液量下總黃酮的變化。由圖2可知，在加液量為20倍以前，白刺花總黃酮的提取率隨加液量倍數(shù)的增大而增大，但加液量達(dá)到20倍后，總黃酮的提取率呈下降趨勢(shì)，即20倍的加液量的提取率達(dá)到高峰，因此加液量為20倍時(shí)較為合適。20倍加液量后總黃酮提取率呈下降趨勢(shì)可能是溶劑體積較大，非黃酮類成分溶解度增大而大量溶出，從而導(dǎo)致白刺花的總黃酮提取率的下降。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響 固定加液量為20倍，乙醇濃度為 60% ，提取溫度為 80 ℃等試驗(yàn)因素，考察提取時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3 h時(shí)白刺花中總黃酮的提取率。由圖3可知，在提取時(shí)間為2 h 時(shí)白刺花總黃酮提取率最高，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率會(huì)降低，在提取時(shí)間為3 h時(shí)提取率最低，故選提取時(shí)間為2 h為最優(yōu)提取時(shí)間。圖上還反應(yīng)出提取時(shí)間太長(zhǎng)，都會(huì)使白刺花中總黃酮被破壞，以致提取率下降。

2.2.3 乙醇濃度對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響 固定加液量為20倍，提取時(shí)間為2 h，提取溫度為80 ℃，考查乙醇濃度分別為40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇時(shí)白刺花中總黃酮的提取率。由圖4可知，隨著乙醇濃度加大，提取液的極性越接近提取物的極性，提取率不斷提高，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，白刺花中總黃酮的提取率達(dá)到最高，70%后再增大乙醇濃度提取率將降低，是因?yàn)橐掖紳舛忍?，白刺花中醇溶性雜質(zhì)及色素等成分溶出增多。因此70%的乙醇濃度為最優(yōu)乙醇濃度。

2.2.4 提取溫度對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響 固定加液量為20倍，提取時(shí)間2 h，乙醇濃度為70%等實(shí)驗(yàn)因素，考查提取溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃時(shí)白刺花中總黃酮的提取率。由圖5可知，溫度升高，提取率在增高，當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃ 時(shí)，白刺花中總黃酮提取率最高，當(dāng)溫度增大到80 ℃時(shí)，總黃酮提取率有所下降，當(dāng)溫度增大到90 ℃時(shí)，總黃酮提取率下降明顯。因此選擇溫度為70 ℃為白刺花總黃酮提取最優(yōu)溫度。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花中總黃酮提取工藝 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度(A)、加液量(B)、提取溫度(C) 和提取時(shí)間(D),利用 Design-Expert 8.0.6軟件中的 Box-Behnken 軟件優(yōu)化白刺花中總黃酮提取條件。以白刺花總黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)[7-8]，以 A、B、C、D 為自變量，以總黃酮提取率為響應(yīng)值(Y) 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。白刺花Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 白刺花中總黃酮提取響應(yīng)面設(shè)計(jì)表

表3 白刺花Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

續(xù)表3表3 白刺花Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

采用Design-Expert 8.0.6軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得回歸方程為:

Y=0.92+0.018A+0.023B+7.500E-003C+0.035D+0.021AB-2.500E-003AC+0.016AD+0.034BC+7.750E-003BD-7.500E-003CD-0.093A2-0.075B2-0.043C2-0.043D2

使用Design-Expert 8.0.6軟件回歸分析對(duì)方程及各因子進(jìn)行方差分析。由表4可知，以白刺花的總黃酮提取率為響應(yīng)值，回歸方程顯著性檢測(cè)P﹤0.0001，表明所得二次方程模型極顯著，而失擬項(xiàng)的P值為0.9986，不顯著，R2=0.9921，表明回歸方程模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合性比較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花中總黃酮提取工藝是可行的，具有參考性[9]，其中各影響因素對(duì)白刺花總黃酮提取率的影響順序?yàn)?提取時(shí)間>加液量>乙醇濃度> 提取溫度。

表4 響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花總黃酮提取率的方差分析表

續(xù)表4表4 響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花總黃酮提取率的方差分析表

表4中一次項(xiàng)乙醇濃度、加液量、提取時(shí)間的P值都小于 0.0001，說(shuō)明都對(duì)白刺花總黃酮的提取率有極顯著的影響，提取溫度的P值為0.0064，小于0.01，表明其對(duì)白刺花總黃酮的提取率有高度顯著的影響; 交互項(xiàng)BC對(duì)白刺花總黃酮提取率的影響極顯著，AD對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響高度顯著，其余不顯著; 二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2均達(dá)到極顯水平說(shuō)明各因素對(duì)白刺花中總黃酮的提取率存在交互影響，而不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系[10]

將表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面的曲面分析，在影響因素中選擇其中兩個(gè)交互的因素對(duì)白刺花中總黃酮的提取率的影響進(jìn)行分析，把其他因素固定為零。根據(jù)回歸方程，考察各影響因素響應(yīng)曲面的形狀，分析各因素對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖6～11所示。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件響應(yīng)曲面優(yōu)化原理，3D曲面圖的坡度越大，說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變影響越大; 反之曲面圖坡度越小，操作條件改變對(duì)響應(yīng)值的影響也就越小[11-12]。圖 6～11反映了乙醇濃度、加液量、提取溫度 和提取時(shí)間四個(gè)因素交互作用對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響，其中乙醇濃度及加液量(圖6)、乙醇濃度及提取時(shí)間(圖8)、提取溫度及加液量(圖9)交互作用3D曲面圖坡度較大，表明這三組對(duì)白刺花中總黃酮提取率的交互作用明顯。

通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化，用Design-Expert 8. 0. 6軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得到白刺花中總黃酮的最佳工藝條件為:乙醇濃度 71.59% ，加液量為21.15倍，提取溫度為71.32 ℃，提取時(shí)間2.22 h；在此條件下模型預(yù)測(cè)總黃酮提取率為0.93118% 。考慮到在實(shí)際操作中，設(shè)備等各條件有限，對(duì)最佳工藝條件修正為:乙醇濃度 72% ，加液量為21倍，提取溫度為71 ℃，提取時(shí)間為133 min。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)所修正的條件進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果白刺花中總黃酮的平均提取率為0.9273%，與模型相對(duì)誤差為0.42%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型擬合較好，利用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化所得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 討論

白刺花中黃酮類化合物含量豐富，具有非常好的藥用、食用、保健作用價(jià)值和開(kāi)發(fā)利用前景。本研究以干燥的白刺花的花粗粉為原料，以乙醇為提取溶劑，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用 Design-Expert 8.0.4 軟件對(duì)白刺花提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。結(jié)果表明最佳的提取工藝條件為:乙醇濃度 72%，加液量為21倍，提取溫度為71 ℃，提取時(shí)間為133 min。優(yōu)化所得到的最佳提取工藝是提取白刺花中總黃酮的有效途徑，為開(kāi)發(fā)保健速溶茶提供可靠的依據(jù)。