何楠，龍安妮，胡暢，劉思博，王遷，邱菊，陳東，李雷

近20年來，心血管外科技術飛速發(fā)展，一些較高難度的手術例數(shù)與日俱增，同時再次手術的比率亦有增多的趨勢[1]。然而，首次手術區(qū)域組織黏連增加了再次手術解剖的難度、手術干預時間及組織損傷的風險。研究顯示，血管周圍黏連程度，也影響手術血管的通暢性[2-5]。物理屏障是臨床上預防術后黏連最有效的方法，但目前尚無針對人體血管的防黏連產品，且市售材料不能滿足血管開放手術所需的高標準及要求。研制一種針對血管手術的防黏連膜，并兼具生物相容性好、柔韌性佳、黏附性強、存留時間足夠、可吸收、抗感染能力強的優(yōu)勢，勢在必行[1]。聚乙烯醇（PVA）及羧甲基纖維素鈉（CMC）這兩種聚合物材料已經美國食品與藥物管理局（FDA）批準用于人體，均具有良好的水溶性和組織相容性。PVA既可制成黏度較大的水凝膠，也可做成軟膏于創(chuàng)傷處成膜而發(fā)揮其他藥物作用，CMC則具備防黏連和一定的止血效果，其干預黏連的機制主要是降低成纖維細胞的活性以及機械隔離作用[6,7]。通過對兩種材料的復合與改性，有望生成一種新型的較理想的血管外科術后防黏連產品。本文采用新西蘭大白兔動物模型，通過皮內刺激實驗、動物實驗等對PVA-CMC復合膜預防血管術后黏連的安全性及有效性進行研究評價。

1 材料與方法

材料 ：PVA-CMC復合膜（三層）規(guī)格為5 cm×5 cm，制備方法見后。新西蘭大白兔：體重2.5 kg，不分雄雌。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規(guī)定。

防黏連膜的制備及理化性質檢測：（1）復合膜制備：中間凝膠膜層中PVA-1799：CMC以30 : 2的比例同時溶解于120份離子水中得到混合溶液，并以5 mg/ml的劑量加入塑形劑，將此混合溶液流延至玻璃培養(yǎng)皿中至厚度500 μm，然后冷凍-解凍過程循環(huán)三次后即制備完成。上下薄膜層中PVA-1788:CMC以2:1的比例同時溶解于離子水中得到混合溶液，以上述方法經過3次冷凍-解凍過程即可。將制作完成的復合膜成分放入環(huán)氧乙烷保鮮袋中行環(huán)氧乙烷滅菌，并在常溫下保存?zhèn)溆?。?）厚度測定：將干態(tài)膜干燥至恒質量，千分尺測定膜的9個不同位置的厚度，取平均值為干態(tài)膜的厚度。將膜浸泡在蒸餾水中24 h，吸干其表面水分，如上同法測定并取平均值為濕態(tài)膜的厚度。（3）含水率測定：將膜浸泡在常溫的蒸餾水中24 h，用濾紙吸干其表面的水分，從膜上均勻裁剪數(shù)個1.0 cm×1.0 cm的樣品，并稱質量取得平均值（w1）。將這些樣品放于70℃的烘箱中烘干至恒質量，取平均值（w）。膜的含水率（%）=（w1-w）/w×100%。（4）溶脹比測定：將干態(tài)膜裁剪成直徑為2.5 cm的圓片，浸泡在蒸餾水中溶脹24 h。用千分尺測量圓片的直徑（φ）和干態(tài)及濕態(tài)膜（σ）的厚度。溶脹比。（5）力學性能測定：將膜裁剪成寬20 mm、夾持長度40 mm，通過電子拉力測試機以20 mm/min的拉伸速率測量其拉伸強度、斷裂伸長率。（6）結構相容性表征：用超高分辨場發(fā)射掃描電鏡JSM7401觀測復合膜的表面形態(tài)結構并分析共混相容性。樣品尺寸2.5 cm×2.5 cm，加速電壓為3.0 kV。

細胞毒性實驗：依據(jù)國家標準GB/T 16175-2008[8]進行測試，對PVA-CMC膜進行毒性分級。同時用顯微鏡觀察法對細胞毒性反應進行綜合評分。

皮內刺激實驗：采用3只體重約2.5 kg的新西蘭大白兔，按順序進行生理鹽水（背部最左）、生理鹽水浸提液（背部最右）、芝麻油（脊正中線右側）、芝麻油浸提液（脊正中線右側）皮內注射，注射劑量為0.2 ml/每注射點，注射點之間間隔2 cm，共10個注射點。注射完成后在1 h、24 h、48 h和72 h時分別進行拍照，并觀察注射的部位有無紅斑或水腫等情況，按照皮內刺激反應記分系統(tǒng)進行評分，并計算原發(fā)性刺激指數(shù)（PII）。

動物頸動脈模型建立：新西蘭白兔16只（體重2.5 kg，雌雄不限），將兔進行自身對照， 即一側頸動脈PVA-CMC復合膜植入（實驗組）和對側頸動脈實施假手術（對照組）。于氣管旁胸鎖乳突肌深面，分離兔頸總動脈，小心游離頸總動脈周圍組織，并摩擦使之明顯滲血，注意保護伴行神經。將PVACMC三層膜裁剪成適合大小約15 mm×8 mm，置入并包裹一側頸總動脈，用6-0 PROLENE縫線標記及固定其位置，于對側頸部單純游離頸總動脈，摩擦使之明顯滲血后用6-0 PROLENE縫線標記其手術位置。

動物實驗標本采集與觀察：（1）大體觀察：術后4周、12周分別處死實驗兔各8只，肉眼觀測術區(qū)頸動脈與周圍組織黏連的程度，并行黏連程度分級：0級（無黏連）、Ⅰ級（黏連輕薄，分離不易出血）、Ⅱ級（中度黏連，需要一些銳性分離，這個過程導致中度出血）、Ⅲ級（黏連致密、彌漫，需要大量的銳性分離，容易出血）。（2）組織學觀察：將兔雙側頸動脈與周圍黏連最明顯部位的組織一起取出，于10%甲醛固定48 h后石蠟包埋并切片，蘇木精-伊紅（HE）染色并封片。顯微鏡下觀察血管與材料及周圍組織的病理情況，微觀黏連評分系統(tǒng)將組織炎癥進行分級：0級（無炎癥反應，未見炎性細胞）、Ⅰ級（輕度炎癥反應，可見少量淋巴細胞和漿細胞、偶可見巨細胞）、Ⅱ級（中度炎癥反應，可見嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨細胞）、Ⅲ級（許多炎性細胞，可見微小膿腫）；同時再對組織周邊纖維化反應進行分級：0級（無纖維化反應）、Ⅰ級（輕度、疏松、局限性纖維化）、Ⅱ級（中度纖維化，薄層局灶纖維結締組織，纖維素沉積）、Ⅲ級（致密、厚層、彌漫性纖維化）。

統(tǒng)計學處理：采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析。兩組獨立樣本比較采用Mann-Whitney U檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

16只實驗兔術后精神、飲食、活動正常，均存活，切口愈合好，無紅腫、滲出或竇道形成。取材前可見頸動脈周圍組織無損傷。

2.2 復合膜的理化檢測及生物相容性測試

理化檢測：（1）厚度測定：干態(tài)膜厚度為（0.320±0.185） mm；濕態(tài)膜厚度為（0.819±0.210） mm。（2）含水率測定： 94.85%。（3）溶脹比測定：（3.22±0.21）%。（4）力學性能測定：干態(tài)膜拉伸 強度 為（27.19±2.43）MPa，斷 裂伸 長率 為（84.5±4.7）%。濕態(tài)膜拉伸強度為（19.63±1.01）MPa，斷裂伸長率為（97.2±8.0）%。（5）結構相容性表征：掃描電鏡在放大倍數(shù)104下可見復合膜表面略粗糙，但完整、未見層次分離。

細胞毒性實驗（MTT法）：PVA-CMC膜1級細胞毒性。

皮內刺激實驗：計算得出復合膜+生理鹽水浸提液的原發(fā)刺激指數(shù)（PII）為0；復合膜+芝麻油浸提液PII最高值為0.27，平均PII值為0.17低于國家標準1.0的規(guī)定要求，可判定PVA-CMC復合膜無皮內刺激作用。

2.3 動物實驗

頸動脈模型大體觀察：術后4周、12周分別處死實驗兔并取材，肉眼觀察可見實驗組（圖1A）手術區(qū)域辨識度極高，膜與周圍組織（氣管、頸前肌群等）的黏連程度低，極少見纖細絲狀黏連，膜的活動度高，可輕松與周圍組織分離，暴露其包裹的頸動脈，過程未見出血。實驗組4周取材的黏連程度評級分布如下：0級7例、Ⅰ級1例、Ⅱ級和Ⅲ級均0例；12周取材情況如下：0級8例，Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級均0例。肉眼觀察對照組（圖1B）血管與周圍組織黏連致密、彌漫，難以分辨術區(qū)組織結構，需要大量的銳性分離，極易出血。對照組4周取材結果：0級、Ⅰ級均為0例，Ⅱ級2例，Ⅲ級6例；12周取材結果：0級、Ⅰ級均為0例，Ⅱ級1例，Ⅲ級7例。不論術后4周還是12周，對照組血管與周圍組織的黏連程度均明顯高于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.0002）。同組內術后12周與術后4周的取材結果差異無統(tǒng)計學意義。

頸動脈模型組織學觀察：對術區(qū)取材并行HE染色、封片，顯微鏡下觀察組織周圍的炎癥反應及纖維囊化形成情況。術后4周，實驗組復合膜周圍少量中性粒細胞、淋巴細胞及多核巨細胞，少許纖維母細胞增生；對照組血管擴張充血，血管內皮無炎癥浸潤，周圍脂肪組織中可見灶狀細胞團，血管周圍有一條細長、薄層局灶纖維結締組織。術后12周，實驗組復合膜膜片與相鄰組織呈分離狀態(tài)，由少量纖維條索包裹，未見炎性細胞，少許纖維組織增生（圖1C）；對照組血管擴張充血，血管內皮無炎癥，血管周圍可見一條致密、厚層、彌漫性纖維化組織（圖1D）。就組織周圍炎癥反應程度而言，無論實驗組還是對照組的術后4周及12周取材結果均是0級8例、其他0例，兩組樣本差異無統(tǒng)計學意義（P=1.000）。而頸動脈周圍組織纖維化反應程度上，實驗組4周取材結果為0級0例，Ⅰ級2例，Ⅱ級6例，Ⅲ級0例； 12周取材結果為0級0例，Ⅰ級4例，Ⅱ級4例，Ⅲ級0例；對照組4周取材結果為0級0例、Ⅰ級0例，Ⅱ級3例，Ⅲ級5例； 12周取材結果為0級0例，Ⅰ級0例，Ⅱ級2例，Ⅲ級6例。統(tǒng)計學分析顯示，術后4周及12周對照組纖維化程度均明顯強于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.015，P=0.002）。

圖1 頸動脈模型大體觀察和組織學觀察結果

3 討論

血管開放手術后經常面臨著二次甚至多次手術的需求。術后血管周圍組織黏連為二次手術的安全性帶來巨大挑戰(zhàn)。另有研究表明，血管重塑與血管術后再狹窄相關，其機制包括外周組織源性平滑肌細胞通過炎癥、黏連遷移至術區(qū)靶血管周邊進而造成內膜增生[9,10]。由于血管結構及其自身搏動和受外力較多等特殊性，對防黏連材料的柔軟性、粘附性及強韌性方面有更高的要求。到目前為止，仍沒有一種理想的、價格適中且適用于血管的防黏連產品。國外雖然已有PVA-CMC復合凝膠材料完成Ⅱ期臨床試驗的安全性報告[11]，但因為血管搏動及長期受外力的特性，其膠態(tài)無法為血管提供全周向防黏連效果。為降低其流動性而更好地適應于血管手術特殊要求，本研究所用的PVA-CMC防黏連材料設計成了粘附性強的復合膜狀，分為中間凝膠膜層及上下薄膜層。理論上可以大大降低血管搏動及外部力量對手術血管的摩擦及軸向剪切力，保持全周向抗黏連能力的同時保護血管外膜結構。本研究表明，該復合膜柔軟、強韌、黏附性好，有望成為開放性血管手術較為理想的防黏連材料。

已有研究提示隨著時間進展，機體對于PVACMC復合膜免疫應答逐漸減弱[12]，其組織相容性良好。本研究將復合膜植入實驗兔頸動脈周邊，以術后4周、12周為節(jié)點進行取材，是因為此時間已經超過了術后黏連發(fā)生的關鍵時期(1周)及黏連的完全成熟期（4～8周），便于觀察復合膜對防止術后血管周圍黏連的最終效果。實驗通過肉眼觀察和組織學觀察均可顯示復合膜包裹的血管周圍組織黏連極少、纖維化程度小，且正因復合膜周圍形成了非常薄的纖維囊腔，使之極易與周邊組織分離，大大減少了二次手術解剖時可能出現(xiàn)的副損傷。術后12周，血管周圍組織內的炎癥及免疫應答基本消失殆盡，故此時觀察兩組術區(qū)均未見炎性細胞浸潤，可解釋實驗組與對照組術區(qū)組織炎癥反應程度一致這一結果。復合膜具有良好的抗纖維化、防黏連作用，作為植入體內的異物卻未在術后較早期（4周）導致術區(qū)炎癥反應，提示復合膜除了物理隔絕作用外，還可能存在一定的抗炎作用，推測其機制可能與該復合膜上下兩層水溶性膜有關，該膜植入體內后最先發(fā)生水溶性膜的緩慢溶解，其中CMC成分被緩慢釋放出來，CMC具有一定的防止感染和止血效果，其與血液接觸時可將血液中水分溶脹產生黏膠狀物，增強血液的濃度與粘性而降低了流速，形成粘性體后將毛細血管殘端封閉，達到止血效果的同時減少了血液內炎癥介質和炎性細胞的滲出，以及它們在創(chuàng)面區(qū)域的聚集。

本研究結果證實PVA-CMC復合膜符合國頒標準GB/T 16886對生物材料、醫(yī)療器械的生物學評價（等同國際標準IS010993）。初步在體實驗證明具備較佳的血管手術后防黏連效果。用于制備該國產新型生物防黏連膜的原材料容易獲得，適合大規(guī)模生產，其多種優(yōu)勢有望應用于血管手術中。除此之外，對于心臟及主動脈的二次手術，黏連重者需要更多的銳性分離，破裂出血、手術時間及麻醉風險增高[13]，本研究所用的復合膜是否在其他外科手術中也能提供良好的防黏連效果，值得考證和期待。