吳勇亮，楊穎康，譚淑雯，彭鐘琴，苗鵬飛，于 輝

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231)

美國毒性物質(zhì)與疾病管理委員會(ATSDR)對毒性物質(zhì)的排序中，重金屬鎘(Cadmium，Cd)位列第7位，國際抗癌癥聯(lián)盟(IARC)于1993年將鎘定為確定性的人類致癌毒物[1]。Cd是非必需、高致毒元素，具有親脂性強(qiáng)、易富集和難降解的特性，可蓄積在人和動物體內(nèi)，并到達(dá)較高的濃度，其中在水環(huán)境中魚類可富集103～105倍[2]。Cd的生物學(xué)毒性主要包括早期發(fā)育階段毒性、遺傳毒性和蛋白毒性[3]，主要表現(xiàn)在干擾細(xì)胞的多種代謝過程，特別是能量代謝、膜運(yùn)輸和蛋白質(zhì)合成，并可能直接或間接地干擾DNA的遺傳控制和修復(fù)機(jī)制等[4]。草魚作為我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物，產(chǎn)量位居淡水養(yǎng)殖魚類第一，因此在分子或基因?qū)用嫔涎芯吭诓蒴~鎘污染暴露下的生物標(biāo)志物，對重金屬的早期預(yù)警，草魚健康養(yǎng)殖具有重要的應(yīng)用意義。

內(nèi)參基因是指其表達(dá)水平不受研究條件的影響且可以在多種樣本間恒定表達(dá)的已知參照基因，用此基因的表達(dá)水平可以準(zhǔn)確量化初始材料的載量。但根據(jù)陳瑞等[5]研究表明，在不同生長階段、不同試驗條件、不同器官組織和不同細(xì)胞類型的樣品中，內(nèi)參基因的表達(dá)水平是不穩(wěn)定的，可能導(dǎo)致以其為內(nèi)參依據(jù)的目的基因表達(dá)量產(chǎn)生較大的誤差，有時甚至引出錯誤或相反的結(jié)論。根據(jù)現(xiàn)有的報道[6-7]可知，草魚內(nèi)參基因穩(wěn)定性篩選的候選內(nèi)參基因一般有β-actin、18S rRNA和GAPDH。在前人試驗[8-9]中，在鎘脅迫下草魚相關(guān)目標(biāo)基因有以β-actin和β2m作為內(nèi)參基因來進(jìn)行分析。但作為鎘脅迫下草魚內(nèi)參基因穩(wěn)定性研究還未見報道。故本試驗候選內(nèi)參基因選擇β-actin、18S rRNA、GAPDH和β2m進(jìn)行研究。

本試驗將以草魚的肝胰臟為材料，利用熒光定量PCR檢測β-actin、18S rRNA、GAPDH和β2m 4個候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平，并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper這三種軟件[10]對各候選內(nèi)參基因的表達(dá)進(jìn)行穩(wěn)定性評價，篩選出最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。為后續(xù)重金屬鎘毒性研究的遺傳毒性生物標(biāo)志物的探索提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 試驗草魚全部取自佛山市南海百容水產(chǎn)良種有限公司，平均體重(11±2)g，隨機(jī)分組飼養(yǎng)于7個經(jīng)消毒的水族箱中。試驗前靜養(yǎng)3 d后，日死亡率低于1%時開始攻毒試驗。根據(jù)本人前期的急性毒性結(jié)果可知重金屬鎘對本批次草魚的96 h的半致死濃度為6.30 mg/L。本次草魚攻毒試驗采取靜態(tài)試驗法[11]，試驗周期為96 h。試驗用藥品氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)為分析純，配成母液后，按比例倒入充分曝氣的水中，稀釋成3.15 mg/L(96 h半致死濃度的50%)的試驗水環(huán)境。取樣時間為鎘脅迫前、鎘脅迫后的6、12、24、48、72、96 h，共七個時間點(diǎn)。每個時間點(diǎn)樣品采集時，從7個水族箱中隨機(jī)撈取3尾草魚到酒精燈旁進(jìn)行解剖，剪取大小適合的新鮮肝胰臟組織用液氮迅速冷凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱中進(jìn)行下一步試驗。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑(Trizol裂解液)購自Invitrogen公司，TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit，TaKaRa熒光定量試劑盒SYBR○RPremixExTaqTMⅡ。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 將采集各處理的樣品用液氮研磨后，使用Trizol裂解液(Invitrogen公司)提取總RNA，然后根據(jù) TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。并于-80 ℃下保存。

1.2.2 引物設(shè)計 選擇4個常見的管家基因18S rRNA，GAPDH，β-actin，β2m作為本試驗的候選內(nèi)參基因。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得18S rRNA，GAPDH，β-actin，β2m的序列，采用Primer 3(http://primer3.ut.ee/)在線軟件分別設(shè)計4種候選管家基因的實(shí)時熒光定量PCR引物(引物信息見表1)，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 4種候選內(nèi)參基因?qū)崟r熒光定量PCR引物Table 1 Four kinds of candidate reference genes for Quantitative Real-time PCR primers

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR 熒光定量試劑盒為TaKaRa SYBR○RPremixExTaqTMⅡ (Perfect Real Time)，熒光定量儀器為ABI PRISM 7500 Fast ReaL-time PCR System。反應(yīng)體系為20 μL,包括：SYBR○RPremixExTaqTMⅡ 10 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，上、下游引物(10 μM)各0.8 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水6 μL。反應(yīng)程序為：①預(yù)變性：95 ℃ 30 sec；②擴(kuò)增反應(yīng)：95 ℃變性5 sec，56 ℃退火30 sec，72 ℃延伸34 sec，40個循環(huán)；③溶解曲線形成：90 ℃ 15 sec，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 15 sec。反應(yīng)結(jié)束后導(dǎo)出內(nèi)參基因Ct值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本試驗采用geNorm 、NormFinder和BestKeeper三種程序?qū)?種候選內(nèi)參基因在草魚不同鎘脅迫時間的肝胰臟的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

根據(jù)公式Q=2Ctmin-Ctsample，將每個擴(kuò)增樣品的Ct值換算成相對表達(dá)量Q(Ctsample為每個樣品的Ct 值，Ctmin為各內(nèi)參基因中最低Ct值)。將相對表達(dá)量Q導(dǎo)入geNorm程序和NormFinder程序來進(jìn)行穩(wěn)定性分析[10,12]。BestKeeper程序是一個內(nèi)置公式的Excel表格，輸入內(nèi)參基因Ct值可以通過內(nèi)置公式計算得到每個內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)，從而對各候選內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性評價[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚候選內(nèi)參基因引物檢測

應(yīng)用常規(guī)PCR對引物特異性進(jìn)行檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1。從圖中可看出引物擴(kuò)增片段與預(yù)期大小相同、條帶單一、無二聚體，說明可用于后續(xù)qRT-PCR分析。

圖1 四對引物的常規(guī)PCR電泳檢測Fig.1 Four pairs of primers in PCR detectionM.Marker;1.GAPDH;2.β2m;3.β-actin;4.18S rRNA

2.2 鎘脅迫不同時間內(nèi)參基因表達(dá)水平分析

對草魚肝胰臟樣品4個候選內(nèi)參基因表達(dá)水平(Ct)進(jìn)行分析(圖2)，由圖2可以看出,18S rRNA在4個候選基因中Ct值最小，轉(zhuǎn)錄最高。

圖2 4個候選內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 Transcript levels of 4 candidate reference genes

2.3 鎘脅迫不同時間內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

geNorm分析結(jié)果是以兩個穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因其表達(dá)穩(wěn)定性相同為假設(shè)，根據(jù)基因之間的配對變異來計算候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性M值，M值越小代表穩(wěn)定性越好。本研究可以得出18S rRNA和β2m的M值最小(見表2)。因此18S rRNA和β2m在geNorm分析中為鎘脅迫不同時間中最合適的內(nèi)參基因。

Normfinder分析的結(jié)果為各個候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值，穩(wěn)定值越小代表穩(wěn)定性越好。本研究表明，GAPDH和18S rRNA的穩(wěn)定值分別為0.423和0.431(見表2)。本試驗表明GAPDH在Normfinder分析中為鎘脅迫不同時間最合適的內(nèi)參基因。

BestKeeper分析主要以結(jié)果中的標(biāo)準(zhǔn)差(STDEV)和變異系數(shù)(CV%)來評定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，兩者越小穩(wěn)定性越好。本研究中，18S rRNA的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)分別為0.28和1.96(見表2)，均為4個候選內(nèi)參基因的最小值。本試驗表明18S rRNA在BestKeeper分析中為鎘脅迫不同時間最合適的內(nèi)參基因。

表2 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的geNorm、Normfinder和BestKeeper分析結(jié)果Table 2 Expression stabilities of candidate reference genes analyzed by geNorm, Normfinder and BestKeeper

3 討 論

為了實(shí)現(xiàn)對環(huán)境的有效檢測，采用生物分子標(biāo)記作為“早起預(yù)警”工具已廣泛應(yīng)用。而qPCR由于操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于對一些潛在分子標(biāo)志物mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測和分析，從而為環(huán)境污染提供有效預(yù)警[13]。在qPCR試驗中，挑選不同細(xì)胞類型或者不同的組織內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)、在不同內(nèi)外因素作用下也能穩(wěn)定表達(dá)、表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似等條件的理想內(nèi)參基因，能有效校正各種試驗誤差[14]。

研究表明，內(nèi)參基因不是一成不變的，即使是同一物種不同因素作用下，符合條件的內(nèi)參基因也不盡相同[15]，魚體在鎘脅迫環(huán)境下也發(fā)現(xiàn)了相同的情況。Gao等[16]研究紅鯉在鎘脅迫下，發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因穩(wěn)定性由好至差的順序為芳香烴受體核易位蛋白2(ARNT2)、18 S rRNA、翻譯延長因子1α(EF1α)、β-actin、GAPDH。Lee等[17]研究發(fā)現(xiàn)皺紋盤鮑在重金屬(銅、鋅和鎘)污染條件下，肝胰腺中β-actin穩(wěn)定性較好。Lang等[18]研究了不同濃度鎘脅迫下斑馬魚的內(nèi)參基因穩(wěn)定性篩選，在肝臟、腎臟和脾臟中β-actin較好，在鰓中GAPDH較好。Chen等[19]探討斑馬魚肝細(xì)胞在鎘環(huán)境中候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明GAPDH的穩(wěn)定性最好，β-actin的穩(wěn)定性最差。本研究通過對4個候選內(nèi)參基因在鎘脅迫不同時間(0、6、12、24、48、72、96 h)中表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行研究，篩選得到鎘脅迫不同時間草魚肝胰臟中最佳內(nèi)參基因為18S rRNA。18S rRNA是真核生物的核糖體RNA的一種，由18S rDNA 轉(zhuǎn)錄而成。18S rDNA在生物中是最為保守的基因之一，所以18S rRNA一般任何情況下都能穩(wěn)定存在，受外界影響調(diào)控較小，是一種最為常用的內(nèi)參基因[20]。Su等[21]對草魚不同組織內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，穩(wěn)定性結(jié)果為18S rRNA > EF1α > GAPDH >β-actin，而在不同時間點(diǎn)對草魚脾臟進(jìn)行呼腸弧病毒感染，內(nèi)參基因穩(wěn)定性篩選結(jié)果為18S rRNA >β-actin> GAPDH>EF1α。董捷[22]用呼腸孤病毒感染草魚后，發(fā)現(xiàn)18S rRNA和β-actin的穩(wěn)定性較高，適合作為內(nèi)參基因。綜合本文試驗結(jié)果，18s rRNA可作為研究草魚鎘脅迫后的相關(guān)基因表達(dá)情況的內(nèi)參基因。

4 結(jié) 論

本試驗的4種候選管家基因在鎘攻毒后草魚肝胰臟中的表達(dá)豐度最高的是18S rRNA，并綜合geNorm、NormFinder和BestKeeper三個程序的分析結(jié)果表明18S rRNA作為內(nèi)參基因來研究鎘攻毒后草魚肝胰臟中目標(biāo)基因的表達(dá)較為穩(wěn)定。本文為后續(xù)鎘脅迫下草魚肝胰臟內(nèi)參基因的選擇提供了試驗依據(jù)，也為后續(xù)生物標(biāo)志物用于檢測重金屬污染奠定了基礎(chǔ)。

第39卷 第7期家畜生態(tài)學(xué)報Vol.39 No.72018年7月Acta Ecologiae Animalis DomasticiJul. 2018