● 王振飛 劉 麗 梁 琳 張 晉 李佳晨 郝 欽▲

肺癌是嚴重威脅人類健康與生命的一種疾病，其發(fā)病率與死亡率均居各種惡性腫瘤之首[1]。造成肺癌患者高死亡率的主要原因在于其高侵襲轉移率。手術和放療無法清除、殺滅轉移的腫瘤細胞，已有的化療藥物大都毒副作用巨大，極大降低了患者的生活質量和治療效果[2]，而且一些化療藥物還會加速腫瘤細胞的進化，促進腫瘤的浸潤和轉移[3]。急需以新的思路研發(fā)無毒、高效的抑制肺癌細胞侵襲轉移的藥物。

中國醫(yī)藥學博大精深，尤其在腫瘤治療方面，更有其獨特之處。它不是僅著眼于殺滅腫瘤細胞，而是提出了“扶正固本”“清熱解毒”“軟堅散結”等一系列治療思路。許多低毒、無毒中藥在腫瘤治療中都發(fā)揮了顯著的功效[4]。北沙參是一味常用無毒中藥，入肺、胃經(jīng)，善治肺臟疾患，具有養(yǎng)陰清肺、生津潤燥、祛痰止咳等作用，在許多抗肺癌方劑中都有廣泛應用[5]。我課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，北沙參可以有效抑制肺癌細胞的遷移和侵襲能力，并探討了它的作用機理。

1 材料

1.1細胞株人正常支氣管上皮細胞系16HBE購自南京凱基生物技術有限公司，人肺癌細胞系H460購自中科院上海生命科學院細胞庫。

1.2藥物北沙參生藥飲片購自內蒙古中醫(yī)院藥房。將生藥磨為細粉，過200目篩，75%乙醇回流提取2次，每次40min，過濾，合并濾液，回收乙醇，濃縮至稠膏，冷凍干燥，得到干粉。干粉用PBS(磷酸鹽緩沖液)溶解，配制成濃度為100mg/mL(按生藥計算)的提取液。

1.3試劑胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液、PBS、胰蛋白酶消化液均購自Gibco公司，CCK-8試劑盒(C16038)購自上海碧云天生物技術有限公司，Marigel基質膠購自BD Biosciences，總RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購自Takara公司，熒光定量PCR試劑盒購自上海翊圣生物，ELISA試劑盒購自北京百智生物技術公司。

1.4儀器二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)，超凈工作臺(蘇州金燕)，倒置相差顯微鏡(Nikon TE2000)，多功能酶標儀SpectraMax? i3x(Molecular Devices)，7500 Real-Time PCR Systems(Applied Biosystem)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)16HBE和H460細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、0.1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基(完全RPMI-1640培養(yǎng)基)中，37°C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.2 CCK-8法檢測細胞毒效應將16HBE細胞懸于完全RPMI-1640培養(yǎng)基中，調整濃度為2.5×104個/mL，接種于96孔板(0.2mL/孔)。培養(yǎng)12h后，藥物組加入北沙參提取液(終濃度為1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL)，對照組加入等體積的PBS。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入CCK-8溶液20μl，培養(yǎng)箱內孵育1h。以450nm為檢測波長、以650nm為參考波長，測定吸光度。

2.3 Transwell法檢測細胞遷移能力將H460細胞以106個/mL懸于無血清RPMI1640培養(yǎng)液。向Transwell小室的每個上室中加入150μl細胞懸液，同時加入北沙參提取液，使其終濃度為5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL；向每個下室中加入650μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24h后，取出上室，吸棄液體，PBS漂洗，棉簽輕輕擦掉膜上面的細胞，濾膜用甲醇固定30min，蘇木素染色15min，顯微鏡下，選取膜的上、下、左、右、中5個不同區(qū)域計遷移細胞數(shù)。

2.4 Matrigel法檢測細胞侵襲能力將H460細胞以106 個/mL懸于無血清RPMI 1640培養(yǎng)液。用預冷的無血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel，取100μl稀釋液加入Transwell小室的上室，小室置于37°C 4h，使膠凝固。向每個上室中加入150μl細胞懸液，同時加入北沙參提取液，使其終濃度為5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL；向每個下室中加入650μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24h后，取出上室，吸棄液體，PBS漂洗，棉簽輕輕擦掉膜上面的Matrigel及未穿過膜的細胞，濾膜用甲醇固定30min，蘇木素染色15min，顯微鏡下，選取膜的上、下、左、右、中5個不同區(qū)域計侵襲細胞數(shù)。

2.5熒光定量PCR法檢測TIMP2(組織型基質金屬蛋白酶抑制劑2)表達水平H460細胞傳代培養(yǎng)24h后，藥物組加入北沙參提取液，使其終濃度為5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL，對照組加入等體積PBS。作用24h后，提取各組細胞的總RNA，經(jīng)濃度和純度檢測后，反轉錄為cDNA，實時熒光定量PCR檢測。PCR條件：95°C 30s，(95°C 5s，60°C 31s)×40個循環(huán)。所用引物：TIMP2上游引物 5’-TCTGGATGGACTGGGTCACA-3’，TIMP2下游引物5’-CTTGATGCAGGC GAAGAACTT-3’；GAPDH上游引物5’-TGTCCCCACTGCCAACGTGTCA-3’，GAPDH下游引物5’-GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算TIMP2的相對mRNA表達量。

2.6 ELISA檢測培養(yǎng)液中TIMP2的含量取對數(shù)生長期的H460細胞，藥物組加入北沙參提取液，使其終濃度為5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL，對照組加入等體積PBS。作用24h后，換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，收集培養(yǎng)上清，按試劑盒說明書操作，檢測TIMP2濃度。

2.7統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析進行檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1北沙參提取液對16HBE細胞增殖能力的影響CCK-8檢測結果顯示，在5mg/mL到15mg/mL濃度范圍內，北沙參提取液對正常支氣管上皮細胞16HBE的增殖能力無影響，說明其對正常支氣管上皮細胞無毒性作用。見表1。

組別OD值對照組0.580±0.0065mg/mL組0.570±0.00810mg/mL組0.564±0.01515mg/mL組0.565±0.014

3.2北沙參提取液抑制H460細胞遷移能力的影響

Transwell遷移實驗顯示，5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的北沙參提取液對H460細胞的遷移能力具有抑制作用，且隨藥物濃度的提高，抑制作用逐漸增強。見表2。

3.3北沙參提取液抑制H460細胞侵襲能力的影響Matrigel侵襲實驗顯示，5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的北沙參提取液對H460細胞的侵襲能力具有抑制作用，且隨藥物濃度的提高，抑制作用逐漸增強。見表2。

組別遷移細胞數(shù) (個)侵襲細胞數(shù)(個)對照組164±14103±85mg/mL組131±9**85±9*10mg/mL組100±11**63±11**15mg/mL組62±5**31±7**

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.4北沙參提取液對H460細胞中TIMP2的表達水平的影響熒光定量PCR結果顯示，5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的北沙參提取液上調了H460細胞中TIMP2的mRNA表達水平，且隨藥物濃度提高，上調幅度逐漸增大。見表3。

組別相對mRNA表達量對照組1.00±0.005mg/mL組1.37±0.09**10mg/mL組1.65±0.08**15mg/mL組2.04±0.19**

注：與對照組相比，**P<0.01。

3.5北沙參提取液對H460細胞TIMP2的分泌水平的影響ELISA結果顯示，5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的北沙參提取液作用于H460細胞后，其培養(yǎng)液中TIMP2的濃度升高，且升高幅度隨藥物濃度提高而提高。說明北沙參提取液可以促進肺癌細胞對TIMP2蛋白的分泌。見表4。

表4 北沙參提取液對H460細胞TIMP2蛋白分泌水平的影響

注：與對照組相比，**P<0.01。

4 討論

已有的抑制腫瘤細胞遷移、侵襲的藥物大多具有較強的毒副作用，給患者的肝臟、腎臟和骨髓造成較大的傷害，嚴重影響其臨床整體療效[6]。北沙參是一味常用中藥。已有研究表明：它具有增強巨噬細胞吞噬能力、抗氧化、逆轉肺纖維化、抑制肺部感染等多種藥理活性[7]。北沙參在很多抗腫瘤方劑中均有應用，但是其確切的抗腫瘤作用機理還不很清楚。本實驗證實，北沙參對正常支氣管上皮細胞不產(chǎn)生細胞毒作用，同時能夠有效抑制肺癌細胞的遷移和侵襲能力。

基質金屬蛋白酶是一類膠原酶，它們可以降解細胞外基質中的膠原成分，破壞腫瘤細胞遷移侵襲的組織學屏障。許多腫瘤細胞都分泌大量的基質金屬蛋白酶到細胞外空間，以利于自身的遷移和侵襲活動。組織型基質金屬蛋白酶抑制劑是一類內源性的基質金屬蛋白酶抑制劑，它們以1：1的比例與細胞外空間的基質金屬蛋白酶結合，并封閉其降解細胞外基質的活性位點，使其無法發(fā)揮促進腫瘤細胞遷移、侵襲的作用[8]。TIMP2是組織型基質金屬蛋白酶抑制劑家族的重要成員，是一種重要的抑癌因子。在肺癌細胞中，TIMP2的合成和分泌水平顯著降低。本研究中，北沙參作用于肺癌細胞后，有效增強了肺癌細胞對TIMP2的合成和分泌，從而有力抑制了肺癌細胞的遷移和侵襲能力。

本研究從細胞和分子層面探究了北沙參的抗腫瘤作用機理，為北沙參的抗腫瘤臨床應用提供了理論依據(jù)。所得結果證明，從中藥，特別是無毒中藥中尋找新型抗腫瘤藥物是一個極有前景的方向。