豆玉鳳，史艷平，李 丹，李小青

西安市兒童醫(yī)院(西安710003)

主題詞 氧化苦參堿 病毒 心肌炎 小鼠 巨噬細(xì)胞移動抑制因子

病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是兒科臨床較常見的心血管疾病，多由病毒侵襲心肌組織引起的彌漫性或局限性病變，病原以柯薩奇病毒最常見[1]。研究顯示近年來病毒性心肌炎發(fā)病率有上升趨勢，且年齡越小，發(fā)病率越高[2]。目前本病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，因而臨床尚無特效的治療措施，多采用對癥治療為主，部分患兒急性期后由于炎癥持續(xù)存在，發(fā)展成慢性心肌炎，出現(xiàn)進(jìn)行性心臟擴(kuò)大、心律失常、心功能減退甚至心力衰竭，預(yù)后不佳。巨噬細(xì)胞移動抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種重要的促炎癥因子，通過抑制巨噬細(xì)胞的移動促進(jìn)巨噬細(xì)胞在炎癥部位浸潤和增生，同時(shí)分泌多種細(xì)胞因子參與炎癥的反應(yīng)。目前已有相關(guān)研究表明MIF與病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。近年來中藥治療病毒性心肌炎報(bào)道不斷，尤其是中藥提取物氧化苦參堿(Oxymatrine，OMT)在心血管系統(tǒng)疾病治療中的顯著療效[3]。本實(shí)驗(yàn)研究MIF在VMC小鼠心肌組織中表達(dá)，探討OMT對VMC保護(hù)作用機(jī)制，為臨床OMT治療病毒性心肌炎提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 材 料 病毒：柯薩奇病毒B3型 (CVB3)，Nancy株，在Hela細(xì)胞中傳代，凍融離心3次后，取上清液分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 動物模型制備 4周齡Balb/c小鼠60只，雌雄各半，體重(15±2)g，隨機(jī)分為4組:空白組、對照組、高劑量OMT組和低劑量OMT組。正常對照組小鼠腹腔接種0.1 ml病毒培養(yǎng)液，其余3組每只鼠經(jīng)腹腔接種0.1 ml CVB3的病毒液，連用7 d，第8天開始OMT灌胃。劑量分別為高劑量OMT組0.1 mg/(kg·d)，1次/d；低劑量OMT組0.025 mg/(kg·d)，1次/d，連用10 d。17 d后，留取小鼠心臟組織，沿左室中線切為兩半，一半放-70℃冰箱保存，用于提取總RNA，另一半用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋作病理學(xué)檢查。

3 檢測方法

3.1 RT-PCR檢測MIF mRNA的表達(dá)：用Trizol試劑提取總RNA，取1.5μg的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后取5 μl的產(chǎn)物行PCR反應(yīng)。MIF引物序列: 上游引物:5′-GTGCCAGAGGGGTTTCTCTC-3′，下游引物:5′-CAGCAGCTTGCTGTAGTTGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度198bp。GAPD H引物序列:上游引物: 5′-ACCACAGTCCTGCATGCCATCAC-3′，下游引物: 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′， 擴(kuò)增產(chǎn)物長度450 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：95℃ 3 min，94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1min，35個循環(huán)后72℃延伸10 min。反應(yīng)完畢后取5 μl的PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描條帶灰度值并進(jìn)行分析。

3.2 病理學(xué)檢查：蘇木素-伊紅(H-E) 染色，在光鏡下觀察心肌組織病理變化， 并計(jì)算心肌病變積分，即計(jì)算每個視野炎性細(xì)胞浸潤和壞死區(qū)域面積與整個視野的面積的比值， 每張切片選取5個高倍視野，無病變計(jì)0 分，< 25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)，表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MIF mRNA的表達(dá)結(jié)果 見圖1。MIF mRNA表達(dá)水平在對照組表達(dá)量高于空白組(P<0.05)，表明MIF在病毒性心肌炎小鼠心肌表達(dá)升高；在氧化苦參堿干預(yù)后MIF mRNA表達(dá)量明顯降低，高劑量OMT組低于低劑量OMT組(P<0.05)。

M：Marker；1：空白組；2：對照組；3：高劑量OMT組；4： 低劑量OMT組

2 心肌病理學(xué)結(jié)果 高劑量OMT組、低劑量OMT組小鼠心肌壞死組織面積與總面積比值低于對照組(P<0.05)。高劑量OMT組心肌炎癥細(xì)胞浸潤與總面積比值低于低劑量OMT組(P<0.05)， 見表1?？瞻捉M見心肌排列規(guī)則，胞漿著色均勻，未見心肌細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞浸潤。對照組可見心肌細(xì)胞壞死崩解，胞核和細(xì)胞輪廓消失，大量的炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)見較多的膠原纖維。高劑量OMT組及低劑量OMT組病變減輕，尤以高劑量OMT組減輕顯著，見表1、圖2。

表1 各小鼠心肌病變積分(分)

注：與對照組比較，*P<0.05

討 論

VMC是由嗜心肌病毒感染心肌細(xì)胞引起心臟疾病，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，多數(shù)研究認(rèn)為病毒可直接損傷心肌細(xì)胞，還可誘發(fā)自身免疫反應(yīng)使心肌細(xì)胞受損，導(dǎo)致心肌細(xì)胞變性、壞死，部分患兒會轉(zhuǎn)為慢性心肌炎，出現(xiàn)心功能不全、頑固性心律失常等危及生命[4]。兒童VMC發(fā)病率逐年上升，若不及時(shí)有效地治療，預(yù)后差甚至威脅患兒生命。細(xì)胞因子在VMC發(fā)病、發(fā)展過程中起主導(dǎo)作用，對其研究檢測可幫助判斷病情及預(yù)后[5]。

圖2 各組小鼠心肌病理學(xué)檢測結(jié)果( HE,×200)

目前VMC治療也缺乏特異性，臨床多采用抗病毒、營養(yǎng)心肌、免疫調(diào)節(jié)等對癥治療，近年來有研究聯(lián)合中成藥治療VMC在臨床取得不錯的治療效果[6]。MIF在1966年被首次發(fā)現(xiàn)，是一種前炎癥細(xì)胞因子，在免疫炎癥反應(yīng)及抗感染等疾病中起了重要作用，隨著對其功能研究的深入，近年來其在心肌炎中的作用也受到廣泛關(guān)注。MIF通過直接抑制巨噬細(xì)胞的移動，導(dǎo)致免疫炎癥性損傷，同時(shí)能刺激巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、TNF-α等，并通過它們介導(dǎo)炎癥性損傷[7]。劉佩友等研究發(fā)現(xiàn)在病毒性心肌炎小鼠心肌組織中MIF mRNA表達(dá)水平升高，預(yù)示MIF在VMC發(fā)病過程中起重要作用[8]。有研究顯示VMC患者血清的MIF水平升高，其血清中磷酸肌酸激酶同工酶也隨之升高，阻斷MIF的表達(dá)能降低心肌病變水平[9]。OMT是豆科槐屬植物苦參的主要有效成分，又名苦參素，具有抗病毒、抗炎、抗心律失常、抗纖維化、免疫抑制及抗腫瘤等藥理作用[10]。文獻(xiàn)報(bào)道OMT能減輕轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，主要發(fā)生在MAPK蛋白翻譯后的磷酸化修飾期，對心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用[11]。有研究表明OMT能保護(hù)內(nèi)源性的氧自由基，提高細(xì)胞中的一氧化碳，一氧化碳合酶，促使冠脈血管舒張，進(jìn)而減少心肌酶的釋放發(fā)揮保護(hù)心肌的作用[12]。本課題組前期研究表明OMT可以明顯提高VMC小鼠存活率[13]。在本研究中MIF mRNA表達(dá)水平在對照組表達(dá)量高于空白組，表明MIF在病毒性心肌炎小鼠心肌表達(dá)升高。對照組未給予OMT干預(yù)治療，其MIF mRNA表達(dá)高于高劑量OMT組及低劑量OMT組，提示OMT可能抑制MIF的表達(dá)，減輕MIF介導(dǎo)的心肌損傷和炎癥反應(yīng)，對心肌起到保護(hù)作用。VMC小鼠給予高劑量OMT干預(yù)治療后，其MIF mRNA表達(dá)較低于低劑量OMT干預(yù)治療后，表明OMT對于VMC的治療作用與劑量呈正相關(guān)。本研究同時(shí)證實(shí)OMT可以明顯改善心肌組織的病理改變，減輕壞死病變和炎癥細(xì)胞浸潤，改善預(yù)后，為臨床OMT治療VMC提供理論依據(jù)。