李東嶺，王深圳，連新明，顏培實(shí)*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所 中國科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；3.青海省動(dòng)物生態(tài)基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008)

近年來，道路修建和運(yùn)營對野生動(dòng)物帶來的影響正成為保護(hù)生物學(xué)的熱點(diǎn)[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，道路分割了動(dòng)物棲息地[4]，將動(dòng)物生活的大面積區(qū)域分裂成小區(qū)域，造成種群隔離[5-6]；修建和運(yùn)營過程對于幼小的野生動(dòng)物(鳥類除外)會(huì)直接導(dǎo)致動(dòng)物的死亡，對于大型野生動(dòng)物會(huì)面臨不能順利通過公路以及及時(shí)采食的危險(xiǎn)[7]，此外動(dòng)物警戒時(shí)間增加，覓食時(shí)間減少[8-9]。因此，如何處理好道路修建與動(dòng)物保護(hù)的關(guān)系引起了人們的廣泛關(guān)注。

皮質(zhì)醇等糖皮質(zhì)激素常被用來衡量動(dòng)物是否處于應(yīng)激狀態(tài)[10]。應(yīng)激狀況下通過皮質(zhì)醇來維持血壓穩(wěn)定以此來維持正常的生理機(jī)能。皮質(zhì)醇水平越高，動(dòng)物受到環(huán)境應(yīng)激越大。傳統(tǒng)的皮質(zhì)醇測量往往是保定動(dòng)物采集血液樣本進(jìn)行測量，但是該方法顯然不適合大型野生動(dòng)物的采集，尤其針對國家級保護(hù)動(dòng)物。利用非損傷方法采集動(dòng)物唾液、尿液和糞便等樣品測定的皮質(zhì)醇含量更能反映出動(dòng)物正常狀態(tài)下的應(yīng)激水平[11-12]。對于野外生活環(huán)境下的野生動(dòng)物，由于野外條件的限定，收集到的新鮮糞樣很難及時(shí)抽提測定，并且糞樣經(jīng)過干燥，會(huì)增大提取率并減少纖維類食物引起含水量增加對激素提取物造成的影響[13]。糞樣處理的方法主要有冷凍干燥法和烘箱干燥法兩種。烘箱干燥與冷凍干燥相比具有操作簡單、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)[14]，但干燥的最佳時(shí)間需要進(jìn)一步研究[15]。

本試驗(yàn)收集新鮮的藏羚羊糞便，來研究不同道路距離對藏羚羊應(yīng)激水平的影響，同時(shí)探討不同干燥處理是否對激素測定產(chǎn)生影響，從而為野生動(dòng)物棲息地內(nèi)的道路建設(shè)以及當(dāng)?shù)匾吧鷦?dòng)物保護(hù)提供指導(dǎo)與建議。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及調(diào)查區(qū)域

本試驗(yàn)選擇區(qū)域是可可西里自然保護(hù)區(qū)的五道梁附近，該區(qū)域位于青藏公路的“中段”?？煽晌骼镒匀槐Ｗo(hù)區(qū)位于青藏高原的西北部，該地主要保護(hù)藏羚羊、藏原羚、野牦牛等高原珍稀野生動(dòng)物。試驗(yàn)研究動(dòng)物為藏羚羊，是國家一級保護(hù)動(dòng)物。選擇該區(qū)域原因有兩點(diǎn)：其一，該地區(qū)是三江源自然保護(hù)區(qū)和可可西里自然保護(hù)區(qū)的交匯處，每年的六、七月藏羚羊會(huì)成群的從越冬地遷往繁殖地，隨后八月份帶羔羊回遷，該地是其遷移的主要地段也是數(shù)量出現(xiàn)較多的地段[16]其二，該區(qū)域是青藏公路沿線放牧較少的地區(qū)之一，可以減少放牧對動(dòng)物行為的影響，從而將道路作為外界環(huán)境影響的主要因素。

該區(qū)域平均海拔約4 600 m左右，氣候寒冷，常冬無夏，7月平均氣溫為5.5 ℃。全年最低氣溫是1月，為-24.8 ℃[17]。該地植被稀少，空氣稀薄，自然環(huán)境極其惡劣。

1.2 試驗(yàn)方法

在青藏公路以2 994～3 005 km路段路標(biāo)作為調(diào)查路段，沿著公路行進(jìn)過程中，看見道路兩側(cè)出現(xiàn)藏羚羊群，就停車觀察，并記錄藏羚羊所在的位置。于2015年8月16～22日進(jìn)行調(diào)查，每次調(diào)查時(shí)間為9：00～11：00，15：00～17：00。這是因?yàn)椴亓缪蚧顒?dòng)會(huì)受時(shí)間的影響，為了減少試驗(yàn)誤差，每天采樣的時(shí)間需要大體一致，調(diào)查過程中一共采集262份糞樣，其中150 m以內(nèi)有26份；150～300 m有51份；300～450 m有77份；450～600 m有84份；600 m以上有24份。為了減少試驗(yàn)誤差，試驗(yàn)過程中，在藏羚羊不受干擾的條件下，待其離開，再收集糞樣。將采集的糞樣裝入保鮮袋中，做好標(biāo)記，同時(shí)用GPS定位，記錄距公路的垂直距離，糞樣裝入車載冰箱中冷凍保存，并及時(shí)地運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室保存，以備測定。研究表明：樣品的新鮮程度會(huì)影響激素含量的變化[14]。為了確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)采集的是新鮮糞樣，其判斷標(biāo)準(zhǔn)是糞便的表面是否濕潤。

糞便激素的前期處理，參照王慧平等[18]、Khan等[19]、Terio等[20]的方法，并作改進(jìn)。方法如下：將-20 ℃冷凍保存的糞便樣品干燥處理(60 ℃)，烘干時(shí)間分別為2 h、4 h、6 h,研磨后稱取0.3 g左右的糞樣，置于15 mL離心管中，加入90%乙醇10 mL，用渦旋震蕩儀輕輕震蕩1 min，置于水浴鍋中60 ℃水浴20 min。然后以4 000 r/min離心機(jī)離心10 min,取出上清液，沉淀中再加入5 mL同上濃度的乙醇，方法同上。將兩次上清液合并，水浴蒸干，然后加入1 mL甲醇，漩渦震蕩1 min,搖勻分裝回收，并放置-20 ℃冰箱中冷凍待測。糞便樣品的激素測定：使用上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)的皮質(zhì)醇試劑盒，測定上述待測樣品。測定具體方法如下：(1)室溫下平衡20 min后取出所需板條，剩余板條放入4 ℃冰箱并用密封袋密封保存；(2)標(biāo)準(zhǔn)孔分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，加入順序按照從低到高的順序加入;樣本孔加入待測樣本50 μL；空白孔不加待測樣本。除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔分別加入過氧化物酶標(biāo)記的抗體100 μL，并用封膜板封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min。(3)棄去廢液，用舊紙排干，每孔加入洗滌劑350 μL，靜置1 min后，棄去洗滌液，并排干，重復(fù)此操作5次。每孔分別加入底物A液和B液50 μL，在37 ℃條件下避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，在15 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各個(gè)孔的OD值。在試驗(yàn)過程中每個(gè)樣本重復(fù)兩次，以便減少試驗(yàn)誤差。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析在IBM SPSS20.0和Excel 2010中進(jìn)行，使用Kologorov-Smirnov 檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。采用單因素方差分別分析三種烘干時(shí)間之間的差異顯著性；以及不同道路距離的糞樣中皮質(zhì)醇激素含量的差異顯著性，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 干燥時(shí)間對皮質(zhì)醇激素含量的影響

干燥時(shí)間分別為2 h、4 h、6 h,試驗(yàn)結(jié)果見圖1。樣品在不同干燥時(shí)間下的含水率分別為21%、8%、3%，計(jì)算濃度時(shí)需換算成絕干樣品。試驗(yàn)結(jié)果表明，干燥處理4 h與干燥處理2 h和干燥處理6 h相比，差異顯著(P<0.05)。這說明干燥時(shí)間不同對激素含量是有一定的影響，在使用烘箱干燥法要仔細(xì)考慮干燥時(shí)間。

圖1 干燥時(shí)間對藏羚羊糞樣中皮質(zhì)醇激素含量的影響Fig.1 The effect of drying time on the cortisol hormone levels in the Tibetan antelope

2.2 道路距離對皮質(zhì)醇激素含量的影響

道路距離主要是指藏羚羊到青藏公路的垂直距離。將采集到的糞樣按距離分為四個(gè)組，分別是0～150 m,150～300 m,300～450 m,450～600 m和600 m以上，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。試驗(yàn)結(jié)果表明，道路距離在150 m以內(nèi)與150 m以外相比，藏羚羊糞樣中的皮質(zhì)醇激素含量，差異顯著(P<0.05)。這說明，150 m以內(nèi)藏羚羊所受的環(huán)境應(yīng)激越大。

圖2 道路距離對藏羚羊糞樣中皮質(zhì)醇激素含量的影響Fig.2 The effect of road distance on the cortisol hormone levels in Tibetan antelope

3 討 論

超低溫冷凍干燥法雖然測定結(jié)果較為精準(zhǔn)[21]，但干燥時(shí)間過長，并且對試驗(yàn)儀器要求較高[14]。烘—箱干燥法具有耗時(shí)短、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，但是干燥時(shí)間和干燥溫度不同，可能會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的偏差。研究發(fā)現(xiàn)，使用烘箱在71 ℃干燥獵豹糞樣3 d后測定其皮質(zhì)醇含量明顯降低[22]。本試驗(yàn)將糞樣干燥的烘箱溫度設(shè)為60 ℃，以確保順利干燥糞樣中游離水的同時(shí)能夠減少皮質(zhì)醇的降解。通過對比干燥2 h、4 h和6 h 的3個(gè)處理時(shí)長的結(jié)果表明，干燥4 h的糞樣中皮質(zhì)醇的含量最高，且與其他兩個(gè)處理組差異顯著(P<0.05)。這可能是由于糞樣干燥2 h時(shí)間太少，此時(shí)樣品的含水率為21%，糞樣不易研磨，導(dǎo)致所有糞樣無法混勻。這與于小杰等[23]對大熊貓糞團(tuán)表層和內(nèi)部的類固醇激素含量的研究結(jié)果一致，即糞樣中皮質(zhì)醇激素的分布是不均勻的藏羚羊主要采食禾本科植物[24]，干燥處理4 h后可完全干燥，此時(shí)樣品的含水率為8%。當(dāng)干燥6 h后，激素含量會(huì)下降。這可能是因?yàn)楦稍飼r(shí)間過長，部分微生物能在加熱期間降解激素[19]。

野生動(dòng)物皮質(zhì)醇激素水平受道路距離的影響。道路距離600 m以上的范圍受到道路的干擾較小，此時(shí)可以認(rèn)為動(dòng)物處于正常的生理狀態(tài)。從圖2可知，皮質(zhì)醇含量在600 m以上距離時(shí)，激素含量較低。距離道路150 m內(nèi)的藏羚羊糞樣中的皮質(zhì)醇含量最高，且與其他距離糞樣中的皮質(zhì)醇含量差異達(dá)到顯著水平，這說明150 m以內(nèi)，藏羚羊所承受的環(huán)境壓力較大。這與李曉曉等[25]的研究結(jié)果一致，即道路會(huì)讓動(dòng)物表現(xiàn)類似應(yīng)對捕食風(fēng)險(xiǎn)的行為，距離道路越近，捕食風(fēng)險(xiǎn)越大，藏羚羊表現(xiàn)警戒行為的比例越高。從收集的糞樣所做的位置標(biāo)志可以發(fā)現(xiàn)，藏羚羊在不同道路距離出現(xiàn)的頻率高低。150～600 m收集到212份糞樣而在150 m以內(nèi)和600 m以上一共收集到50份糞樣，這表明藏羚羊在距公路150～600 m范圍內(nèi)出現(xiàn)的頻率較高。這與連新明等[8]所發(fā)現(xiàn)的藏羚羊平均活動(dòng)范圍距道路580 m相一致。藏羚羊距離公路較近出現(xiàn)的頻率較少，這是因?yàn)椴亓缪蛏阅懶。苋祟惢顒?dòng)干擾會(huì)遠(yuǎn)離道路。同時(shí)道路會(huì)阻礙動(dòng)物在道路間的活動(dòng)，其阻礙能力與動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力、道路寬度、交通量三個(gè)因素有關(guān)[26]。野生動(dòng)物其生理狀況和行為活動(dòng)存在一一對應(yīng)關(guān)系，在未來的野生動(dòng)物動(dòng)物研究中，可以測定其生理反應(yīng)來推測動(dòng)物的行為活動(dòng)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中，干燥處理4 h糞樣中皮質(zhì)醇含量較高。在使用烘箱干燥處理時(shí)，要考慮干燥時(shí)間對皮質(zhì)醇含量的影響。此外，道路距離對藏羚羊應(yīng)激也會(huì)產(chǎn)生影響，在以后自然保護(hù)區(qū)的道路修建中要注意規(guī)劃，減少對動(dòng)物應(yīng)激的影響。