莫美絨，崔 尖，趙曉慧△

(1.北京市順義區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗科 101300；2.陜西省結(jié)核病防治院檢驗科，西安 710000)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，2012年全球卵巢癌新發(fā)病例239 000例，死亡152 000例[1]。盡管80%的卵巢癌血清糖類抗原(CA)125會升高，但由于靈敏度及特異度較低，仍無法作為評估術(shù)后復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的指標(biāo)[2]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)作為液體活檢的新型指標(biāo)，已廣泛用于多種惡性腫瘤的預(yù)后評估[3]。本研究旨在探討基于CellSearch系統(tǒng)檢測CTC在卵巢癌中的陽性情況和臨床意義，了解CTC與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系，進(jìn)一步為臨床個體化治療及預(yù)后評估提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年5月至2014年3月在北京市順義區(qū)中醫(yī)醫(yī)院診斷為卵巢癌患者56例，平均年齡(58.71±8.57)歲，患者腫瘤分期采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(FIGO)2009標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 病理結(jié)果顯示卵巢癌；(2)接受規(guī)范分期手術(shù)的患者；(3) 術(shù)前未接受放化療或內(nèi)分泌治療；(4) 隨訪資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)治療前已接受過放化療或內(nèi)分泌治療；(2)5年內(nèi)曾有其他腫瘤病史；(3) 未能進(jìn)行規(guī)范分期手術(shù)；(4) 有凝血相關(guān)疾病無法采血者；(5) 拒絕采集外周血進(jìn)行檢測；(6)隨訪資料不全者。本研究征得患者及家屬同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實施。

1.2儀器與試劑 采用強生CellSearch系統(tǒng)進(jìn)行檢測，所用CTC試劑盒(CellSearch CTC KIT)購自強生公司；Celltracks-AutoPrep樣本處理系統(tǒng)(強生公司)，Celltracks-analyzer分析系統(tǒng)，CellSave含乙二胺四乙酸抗凝劑的儲存管(強生公司)，試驗所需的一抗購自美國BD公司。

1.3方法

1.3.1CTC檢測 納入研究的患者于術(shù)前采集外周靜脈血7.5 mL放入CellSave管，充分混勻，防止凝集；72～96 h內(nèi)送CellSearch系統(tǒng)檢測CTC時，采用免疫磁珠方法富集表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)的上皮細(xì)胞,所富集的細(xì)胞經(jīng)固定、透化等處理后采用角蛋白Cytokerins抗體(CK8、CK18、CK19等)、CD45抗體進(jìn)行免疫染色，最后采用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色來鑒定細(xì)胞核。染色完成后,細(xì)胞集中進(jìn)入多通道熒光顯微鏡進(jìn)行分析,CTC細(xì)胞特征為CK+/DAPI+/CD45-，并由2名經(jīng)驗豐富的檢驗專家進(jìn)行計數(shù)。

1.3.2CTC分組 將納入研究患者按照CTC計數(shù)進(jìn)行分組，計數(shù)大于或等于1個者即為CTC陽性組，等于0個者即為CTC陰性組。

1.3.3隨訪 采用電話隨訪的方式，自手術(shù)當(dāng)日起隨訪，截止時間為2017年3月1日，每3個月隨訪1次；隨訪內(nèi)容包括腫瘤復(fù)發(fā)時間、部位、死亡及死亡原因等，共失訪4人，平均隨訪時間為(22.3±17.2)個月。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0及Graphpad軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法；生存分析采用Kaplan-Meier法log-rank檢驗；單因素及多因素分析采用Cox比例風(fēng)險模型。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CTC在卵巢癌中的陽性表達(dá)情況 CTC在卵巢癌中的陽性率為37.5%(21/56)，CTC計數(shù)范圍為0～7個。CTC表現(xiàn)為卵圓形，標(biāo)記物DAPI+/CK+/CD45-的細(xì)胞。其中核與角蛋白不重合或CD45+的細(xì)胞均為非CTC。

2.2CTC陽性與臨床病理因素的關(guān)系 將CTC陽性組、陰性組與卵巢癌患者臨床病理因素分析，結(jié)果顯示CTC陽性患者與腫瘤分化(P=0.003)、FIGO分期(P=0.003)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.004)及復(fù)發(fā)(P<0.001)相關(guān)，而與年齡、血清CA199、血清CA125及血清人附睪分泌蛋白4(HE4)無相關(guān)性，見表1。

2.3CTC與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系 CTC陽性組術(shù)后5年總生存率為47.62%，而CTC陰性組為91.43%，CTC陽性組5年總生存率低于CTC陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.032)；CTC陽性組5年累計復(fù)發(fā)率為76.19%，CTC陰性組為17.14%,CTC陽性組5年累計復(fù)發(fā)率高于CTC陰性組，差異有統(tǒng)計意義(P=0.033)。

2.4CTC與卵巢癌預(yù)后因素分析 單因素分析示FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化及CTC陽性為影響總生存率及累計復(fù)發(fā)率的影響因素，見表2；多因素分析示腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CTC陽性為影響總生存率及累計復(fù)發(fā)率的獨立影響因素，見表3。

表1 CTC與卵巢癌患者臨床病理因素的關(guān)系[n(%)]

表2 單因素分析總體生存率和累計復(fù)發(fā)率的影響因素

表3 多因素分析總體生存率和累計復(fù)發(fā)率影響因素

3 討 論

研究結(jié)果顯示，盡管已有多種治療方法對卵巢癌患者進(jìn)行治療和干預(yù)，仍然有70%的患者將在18個月內(nèi)復(fù)發(fā)[4]。2017年美國預(yù)計因卵巢癌死亡的患者將達(dá)14 080例[5]。

CTC作為新型液體活檢標(biāo)志物，在多種研究中已證實其對藥效評估及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測作用[6]。本研究應(yīng)用唯一通過美國FDA批準(zhǔn)的CellSearch系統(tǒng)對卵巢癌患者外周血行CTC檢測，結(jié)果提示陽性率為37.5%(21/56)。而在LEE等[7]的研究中，通過微流體平臺對患者血漿CTC檢測提示陽性率可高達(dá)98.1%(53/54)，但其CTC計數(shù)與卵巢癌患者的無進(jìn)展生存并不相關(guān)。在本研究中，隨訪結(jié)果提示CTC陽性組與陰性組的患者相比總體生存率更低(P=0.032)，術(shù)后累計復(fù)發(fā)率更高(P=0.033)。該結(jié)果與另一項同樣適用CellSearch系統(tǒng)進(jìn)行檢測的研究結(jié)果相一致[8]，即CTC計數(shù)升高是預(yù)后不佳的指標(biāo)之一。此外，本研究發(fā)現(xiàn)CTC陽性與腫瘤分化(P=0.003)、FIGO分期(P=0.003)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.004)及復(fù)發(fā)(P<0.001)密切相關(guān)。但LIU等[9]的研究則表明CTC計數(shù)無論與臨床病理參數(shù)或患者預(yù)后均不相關(guān)。且在本文中，CTC計數(shù)的范圍波動為0～7枚，該結(jié)論也與既往研究相接近[9]。KOLOSTOVA等[10]的研究提示在卵巢癌中，CTC主要提示血液擴散情況，而CA125主要提示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。但在其他腫瘤研究中提示血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合CTC評估腫瘤預(yù)后的能力更佳[11]。本研究中，陽性CTC與CA125之間并無相關(guān)性，提示淋巴轉(zhuǎn)移及血液轉(zhuǎn)移可能是獨立不相關(guān)的兩種因素。此外，在對腫瘤治療的應(yīng)答評估中，傳統(tǒng)的方法主要依賴臨床及影像學(xué)資料，但在THALGOTT等[12]的研究中表明治療過程中CTC計數(shù)的變化與影像學(xué)實體腫瘤的變化相一致。且通過體外培養(yǎng)捕捉到CTC，對其進(jìn)行后續(xù)藥效試驗及測序分析，可為患者個體化治療提供可靠依據(jù)。

本研究也存在一些不足，如本研究為單中心小樣本研究，且當(dāng)腫瘤發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而失去上皮標(biāo)志物時，極有可能無法被依賴于上皮標(biāo)志物檢測的CellSearch系統(tǒng)所檢測到。且對于所獲得的CTC，并未進(jìn)行后續(xù)相關(guān)分子分析。未來仍需要更大樣本和更為成熟的檢測方法和體系來對外周血CTC進(jìn)行深度分析。

綜上所述，本研究表明在卵巢癌患者外周血中可檢測到陽性CTC，且其與臨床病理特征相關(guān)，CTC陽性患者5年總生存率低于CTC陰性者，5年累計復(fù)發(fā)率高于CTC陰性者，CTC陽性為影響總生存率及無瘤復(fù)發(fā)率的獨立危險因子。