何 靜，余小燕，溫瑋霞，陳江濤，紀 妍

(廣東省惠州市中心人民醫(yī)院：1.產(chǎn)前診斷中心；2.一分院辦公室 516001)

血紅蛋白病是一類珠蛋白基因變異而導致血紅蛋白異常的遺傳病，是世界上最常見的單基因遺傳病。全世界目前發(fā)現(xiàn)的珠蛋白基因變異類型超過1 500種[1]，大約1.5億人攜帶有相關基因[2]，以熱帶和亞熱帶地區(qū)分布較廣。我國血紅蛋白病存在明顯的民族和地域的差異性，其中我國南方地區(qū)尤其是兩廣和海南地區(qū)發(fā)病率較高，給相關家庭和社會造成了嚴重的生理、心理和經(jīng)濟負擔?；葜莸貐^(qū)位于廣東省中南部，珠三角東北端，是客家人的重要聚居和集散地之一，具有高攜帶風險的地域特征。本研究收集2015年7月至2017年6月于本院體檢者及門診、住院患者靜脈血，以血液學特征為基礎，與基因型研究相結(jié)合，旨在獲得異常血紅蛋白的分子流行特征，以便更好地指導優(yōu)生方面的臨床工作，為重型地中海貧血患兒出生的預防工作提供依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年7月至2017年6月于本院體檢，以及門診、住院患者靜脈血，受試者總數(shù)為22 546例，年齡10～65歲。

1.2方法

1.2.1標本采集及血常規(guī)分析方法 分別采集受試者靜脈血2 mL于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝的真空管，紅細胞的各項參數(shù)采用日本Sysmex XT-1800i全自動血細胞分析儀進行分析。主要血液學參數(shù)指標有：血紅蛋白、平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)和紅細胞體積分布寬度(RDW)。下列情況之一者確定為有異常血紅蛋白可能：(1)MCH<27 pg；(2)MCV<80 fL。

1.2.2血紅蛋白電泳及異常條帶定量 參照《全國檢驗操作規(guī)程(第4版)》的微量醋酸纖維膜血紅蛋白電泳法行篩選異常血紅蛋白及血紅蛋白F>5%的標本，用Sebia電泳儀進一步確認和確定其水平，異常血紅蛋白電泳區(qū)帶位置將區(qū)帶分為：H、J、K、A、F、Q、G/D和E區(qū)帶。

1.2.3DNA提取 使用Fujifilm DNA提取儀，取初篩陽性者抗凝血100 μL，按照全血基因組DNA提取試劑盒(深圳亞能生物科技有限公司)說明書提取基因組DNA。

1.2.4α和β珠蛋白的基因擴增 對于MCV<80 fL且血紅蛋白 A2<2.5%的標本行α地貧基因篩查；對于MCV<80 fL且血紅蛋白 A2>3.5%的標本行β地貧基因篩查；對于出現(xiàn)異常血紅蛋白電泳條帶的標本，異常血紅蛋白水平<40%或有血紅蛋白 A衍生條帶行α地貧基因篩查，異常血紅蛋白水平>25%行β地貧基因篩查。α地貧基因篩查程序為：用提取的全血基因組DNA先采用裂口PCR(gap-PCR)技術(shù)測定4種常見缺陷型α地貧基因(--SEA、-α3.7、-α4.2、--THAJ)，其檢測陰性者繼續(xù)用反向斑點雜交(PCR-RDB)技術(shù)測定3種常見非缺失型α地貧基因；β地貧基因篩查方法為用PCR-RDB法測定17種β地貧基因；PCR-RDB法中PCR后，RDB檢測滿足的條件為，當非缺失型α地貧基因樣本行PCR后可見1 000 bp片段擴增條帶，β地貧基因樣本行PCR后可同時見600 bp和200 bp片段兩條擴增。所有基因檢測試劑盒均為中山大學達安基因公司提供，操作程序按照試劑盒說明書進行，引物序列和擴增體系均參照文獻[3]。

1.2.5PCR擴增產(chǎn)物的序列測定 對其PCR產(chǎn)物純化后，使用ABI3730雙向測序。

1.3統(tǒng)計學處理 采用Microsoft Excel2007對數(shù)據(jù)進行整理。

2 結(jié) 果

2.1電泳篩查結(jié)果 22 546例研究對象中，異常血紅蛋白共計102例，其發(fā)生率為0.45%(102/22 546)。包括14.7%(15/102)J區(qū)帶血紅蛋白異常、14.7%(15/102)K區(qū)帶血紅蛋白異常、21.6%(22/102)Q區(qū)帶血紅蛋白異常、30.4%(31/102)G/D區(qū)帶血紅蛋白異常和18.6%(19/102)E區(qū)帶血紅蛋白異常。

2.2異常血紅蛋白基因類型 102例異常血紅蛋白標本中，檢出α珠蛋白突變類型8種，見表1。變異體共計55例，基因頻率為1.02×10-3；α珠蛋白變異體最常見的變異類型為血紅蛋白CS，共32例，占58.2%(32/55)；其中血紅蛋白CS是通過PCR-RDB法鑒定，其他7種均通過PCR測序鑒定。檢出β-珠蛋白突變類型6種，見表2，變異體共計47例，基因頻率為1.22×10-3；β-珠蛋白變異體最常見類型為血紅蛋白E，共19例，占40.4%(19/47)；其中血紅蛋白E是通過PCR-RDB法鑒定出來，其他5種均通過PCR測序鑒定。

表1 α珠蛋白變異體類型及各類型所占比例

表2 β珠蛋白變異體類型及各類型所占比例

3 討 論

血紅蛋白病是由于構(gòu)成血紅蛋白的珠蛋白肽鏈發(fā)生單個或幾個氨基酸的替換、插入或重復而導致異常血紅蛋白鏈產(chǎn)生或因為某種珠蛋白合成被抑制而導致血紅蛋白合成量減少而引起的貧血，分別被稱為異常血紅蛋白病和地中海貧血。異常血紅蛋白病是遺傳上缺陷導致珠蛋白鏈分子結(jié)構(gòu)異常的一類血紅蛋白異常的疾病，表現(xiàn)在一級結(jié)構(gòu)上可以是α、β、γ和δ珠蛋白的任何一種結(jié)構(gòu)的異常。其分子學異常是以基因結(jié)構(gòu)改變?yōu)榛A的，常見的基因結(jié)構(gòu)改變模式有：(1)密碼子中單個堿基突變；(2)密碼子缺失和插入；(3)移碼突變；(4)終止密碼子變異；(5)不同基因間的交換產(chǎn)生融合基因。而這些基因結(jié)構(gòu)改變引起的血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)的異?？梢苑譃橐韵聨追N情況：(1)珠蛋白上發(fā)生單個氨基酸替代，如β鏈上第26位谷氨酸被賴氨酸替代的血紅蛋白E；(2)珠蛋白鏈中發(fā)生兩個或以上的氨基酸被替換，如β鏈上第9位絲氨酸被酪氨酸替換和121位谷氨酸被谷氨酰胺替換的血紅蛋白D-Agri；(3)氨基酸缺失，如β鏈上第6位谷氨酸缺失的血紅蛋白Leiden；(4)重復氨基酸的嵌入，如α鏈上第119位脯氨酸后出現(xiàn)前面117～119位3個氨基酸(Phe-Thr-Pro)重復的血紅蛋白Grady；(5)珠蛋白肽鏈末端延長，如α鏈上第142位終止密碼子變成谷氨酰胺導致肽鏈延長的血紅蛋白Constant Spring；(6)珠蛋白肽鏈末端縮短，如β鏈上第145位酪氨酸和146位組氨酸缺失的血紅蛋白Mckees Rocks；(7)融合型珠蛋白肽鏈，如δ鏈和β鏈融合的血紅蛋白Lepore。以上模式里又以單個堿基突變最為常見，導致珠蛋白鏈中單個氨基酸替換而引起結(jié)構(gòu)異常[4]。本研究中所出現(xiàn)的異常血紅蛋白的8種α珠蛋白變異體和6種β珠蛋白變異體都屬于這種情況。

國內(nèi)血紅蛋白病的主要類型為α和β地中海貧血，其高發(fā)區(qū)為我國南方的兩廣和海南地區(qū)，發(fā)病率為4.4%～15.2%[5-6]。學者們對廣東省地貧基因人群攜帶情況研究較多，但對該地區(qū)人群異常血紅蛋白的研究相對較少。我國目前已發(fā)現(xiàn)80多種異常血紅蛋白，大多臨床癥狀輕微甚至無臨床癥狀，但當合并地貧時可能會表現(xiàn)出中到重度貧血，而目前缺少有效的治療手段，患者只能依賴長期輸血進行治療，給家庭和社會都造成了沉重的負擔。有研究表明[7]，我國長江以南地區(qū)異常血紅蛋白平均發(fā)生率為0.367%，明顯高于長江以北的0.290%；其中北方以甘肅和新疆發(fā)病率最高，平均為0.414%；而南方的高發(fā)地區(qū)是云南、福建、廣西、廣東和江西，其中又以云南最高，達6.06%，其中血紅蛋白E最為常見。有研究者在2009年和2011年在廣東潮州和梅州地區(qū)分別進行了涉及10 000余人的血紅蛋白流行病調(diào)查，梅州地區(qū)異常血紅蛋白發(fā)生率為0.479%，其中α珠蛋白變異體33例(45.2%)，β珠蛋白變異體40例(54.8%)；潮州地區(qū)異常血紅蛋白發(fā)生率為0.358%，其中α珠蛋白變異體19例(46.4%)，β珠蛋白變異體22例(53.6%)[8-9]；馬占忠等[10]調(diào)查廣東韶關地區(qū)異常血紅蛋白的發(fā)生率為0.46%，α珠蛋白變異體25例(55.6%)，β-珠蛋白變異體20例(44.4%)；王婷[3]調(diào)查廣東東莞地區(qū)異常血紅蛋白的發(fā)生率為0.4%，α珠蛋白變異體74例(56.5%)，β珠蛋白變異體57例(43.5%)。本研究中廣東惠州地區(qū)異常血紅蛋白的發(fā)生率為0.45%，α珠蛋白變異體55例(53.9%)，β珠蛋白變異體47例(46.1%)，表明惠州地區(qū)跟廣東省其他地區(qū)相似，異常血紅蛋白及所并發(fā)的地中海貧血也是該地區(qū)重要的公共健康問題之一?；葜莸貐^(qū)地處廣東省中南部，珠三角東北端，居民以客家人為主。客家民系是客家先民(南遷漢族移民)進入嶺南后與閩粵贛地區(qū)的古越族先民融合而形成的，該民系具有北方人群和南方人群交匯融合的特點。從本研究看，既有較高比例的北方人群常見的異常血紅蛋白G/D區(qū)帶，也具有南方人群常見的異常血紅蛋白E和J區(qū)帶。本研究表明，該地區(qū)異常血紅蛋白 以血紅蛋白CS、血紅蛋白E、血紅蛋白New York、血紅蛋白Q-Thailand、血紅蛋白G-Taipei和血紅蛋白G-Honolulu為主，這與王婷[3]報道的梅州和東莞地區(qū)的研究結(jié)果較為接近，可能與兩地地理位置接近有關。

綜上所述，廣東惠州地區(qū)是異常血紅蛋白的高發(fā)區(qū)，且基因種類較多，以血紅蛋白CS和血紅蛋白E最為常見，其次血紅蛋白New York、血紅蛋白Q-Thailand、血紅蛋白G-Taipei和血紅蛋白G-Honolulu也較多見。該地區(qū)異常血紅蛋白基因有其獨特性，但也與周邊地市區(qū)域流行種類較為接近，符合廣東地區(qū)異常血紅蛋白的地域流行特征。