陳沿霖，郭愛，彭鵬，周梅，谷中婭，劉筱晗，張夢喆，鄧艷秋

阿爾茨海默?。ˋD）又稱老年性癡呆，是一種常見的以進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶減退為主要臨床癥狀的神經(jīng)退行性疾病，其兩大特征性病理改變是細(xì)胞間淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成的老年斑（SP）和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs），且NFTs與老年癡呆程度呈正相關(guān)［1-2］。過度磷酸化的細(xì)胞骨架蛋白Tau和神經(jīng)絲（NFs）與NFTs形成密切相關(guān)，是AD的早期病變，其在AD神經(jīng)變性發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用［3］。Tau蛋白和NFs的磷酸化和腦內(nèi)糖代謝產(chǎn)生的O-糖基化存在競爭關(guān)系，AD腦內(nèi)糖代謝和胰島素信號紊亂與Tau蛋白和NFs的磷酸化密切相關(guān)［4-5］。而2型糖尿?。═2DM）也存在胰島素信號異常和糖代謝紊亂，研究表明T2DM患者AD發(fā)病率增高且發(fā)病時間提前，因此AD也被稱為第三類型糖尿病［6-7］。胰高血糖素樣肽（GLP）-1是一種腸促胰島素，前期研究發(fā)現(xiàn)GLP-1類似物如利拉魯肽和受體激動劑艾塞那肽能改善AD鼠模型的記憶和認(rèn)知功能［8-10］。本研究通過應(yīng)用GLP-1受體（GLP-1R）拮抗劑Ex9-39和PI3K抑制劑渥曼青霉素（wortmannin）觀察杜拉魯肽對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞AD樣變的Tau和NFs異常磷酸化的保護(hù)作用并探討其機(jī)制，為改善AD藥物的研發(fā)提供依據(jù)［11］。

1 材料與方法

1.1 材料 SH-SY5Y細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，杜拉魯肽、PI3K抑制劑wortmannin和GLP-1R拮抗劑Ex9-39分別購自禮來公司、Sigma公司和杭州中肽公司；Tau和神經(jīng)絲蛋白的抗體購自Thermo Fisher和Biolegend公司；R61d多克隆抗體由美國IBR研究所饋贈；兔源Total/Phospho-PI3K（p85），Total/Phospho-GSK3β（S9）多克隆抗體購自 Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體和羊抗兔抗體購自Abcam公司；β-actin抗體、BCA試劑盒、組織裂解液RIPA和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒分別購自中國碧云天生物技術(shù)研究所、索萊寶公司和Milipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 SH-SY5Y細(xì)胞采用DMEM/F12培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、0.1%鏈霉素+青霉素）于37℃、5%CO2孵育中貼壁生長，每2～3 d更換1次培養(yǎng)基。細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，傳代或用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為6組：空白對照組（CON組），磷酸鹽緩沖液（PBS）處理12 h；wortamannin干預(yù)組（W組），1μmol/L wortamannin處理12 h；杜拉魯肽干預(yù)組（D組），10 nmol/L杜拉魯肽處理12 h；杜拉魯肽與wortmannin共同干預(yù)組（D+W組），10 nmol/L杜拉魯肽和1μmol/L wortamannin共同處理12 h；杜拉魯肽+wortmannin+Ex9-39共同干預(yù)組（D+W+E組），10 nmol/L杜拉魯肽、1μmol/L wortamannin和10μmol/L Ex9-39共同處理12 h；Ex9-39干預(yù)組（E組），10μmol/L Ex9-39處理12 h。各藥物濃度根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定［12］。

1.2.2 改良MTT法測定細(xì)胞活性 胰酶消化SH-SY5Y后室溫1 000×g離心5 min，棄去上清，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后1×104個/孔接種于96孔板，每組10個復(fù)孔。待生長至80%匯合度時，細(xì)胞無血清化后按照上述分組處理，處理結(jié)束后每孔加入0.5%MTT溶液10μL，37℃孵育4 h后每孔加入100μL DMSO于搖床上輕搖10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處各孔光密度（OD）值。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞以1×106個/孔接種于6孔板，參照1.2.1進(jìn)行分組處理，處理后的細(xì)胞加入RIPA裂解液（含1 mmol/L PMSF）4℃裂解30 min后，16 000×g離心10 min取上清。BCA法測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，7.5%或10%分離膠），濕轉(zhuǎn)法（280 V，300 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h）將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA封閉30 min后，一抗4℃孵育過夜，二抗（1∶10 000）室溫2 h，ECL發(fā)光，曝光，Image J軟件分析各檢測結(jié)果。用β-actin做內(nèi)參，Tau5抗體檢測Tau蛋白總量，tau［pS396］、tau［pS404］、tau［pS262］抗體檢測Tau蛋白在396、404和262位點(diǎn)的磷酸化水平；用SMI31抗體檢測細(xì)胞內(nèi)中、高分子質(zhì)量神經(jīng)絲蛋白（NF-M和NF-H）的磷酸化水平，以識別總神經(jīng)絲蛋白的R61d為內(nèi)參，檢測NF-M和NF-H的總體水平；用Total/Phospho-PI3K（p85）抗體和 Total/Phospho-GSK3β（S9）抗體檢測PI3K和GSK3β的磷酸化水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，CON組、W組、D組和D+W組均數(shù)比較采用析因設(shè)計的兩因素方差分析，CON組與E組、D+W組與D+W+E組均數(shù)比較均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，用Graphpad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測不同藥物對細(xì)胞活力的影響 杜拉魯肽干預(yù)后細(xì)胞活力上升（F=293.112，P＜0.01）；wortamannin干預(yù)后SH-SY5Y細(xì)胞活力下降（FW=162.630，P＜0.01），杜拉魯肽和wortamannin存在交互效應(yīng)，D+W組細(xì)胞活力上升（F交互=19.840，P＜0.05）。Ex9-39干預(yù)后SH-SY5Y細(xì)胞活力下降（t=4.423，P＜0.01），D+W+E組的細(xì)胞活力較D+W組降低（t=9.406，P＜0.01），見圖1。

Fig.1 Changes of cell viability detected by MTT assay in six groups圖1 MTT法分析各組細(xì)胞活力變化

2.2 杜拉魯肽改善wortmannin誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白的過度磷酸化 （1）wortamannin和杜拉魯肽干預(yù)后對細(xì)胞內(nèi)總Tau蛋白沒有明顯影響（F分別為0.333和0.253，均P＞0.05），Ex9-39干預(yù)也沒有明顯影響（t=0.182，P＞0.05）。（2）wortamannin干預(yù)后Tau蛋白pS262、pS396和pS404位點(diǎn)磷酸化表達(dá)明顯升高（F分別為267.814、196.761、510.729，均P＜0.01），而杜拉魯肽干預(yù)后Tau蛋白上述3個位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)下降（F分別為219.231、119.028、15.182，均P＜0.01），杜拉魯肽和wortamannin存在交互效應(yīng)，D+W組Tau蛋白pS262、pS396和pS404位點(diǎn)磷酸化表達(dá)下降（F交互分別為 49.190、24.290、5.466，均 P＜0.05）。Ex9-39干預(yù)后 Tau蛋白 pS262、pS396和pS404位點(diǎn)磷酸化表達(dá)明顯升高（t分別為7.994、14.241、15.761，P＜0.01），D+W+E組tau蛋白上述位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)高于D+W組（t分別為4.899、5.765、2.440，均P＜0.05），見圖2。

Fig.2 Expressions of total Tau protein and pS262,pS396 and pS404 detected by Western blot assay in SH-SY5Y cells圖2 Western blot檢測SH-SY5Y cells Tau蛋白及磷酸化表達(dá)

2.3 杜拉魯肽減少wortmannin誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)NF-H/M磷酸化水平 （1）wortamannin和杜拉魯肽干預(yù)后對細(xì)胞內(nèi)NF-H和NF-M神經(jīng)絲均沒有明顯影響（F分別為0.300、2.700和0.370和0.333，均P＞0.05），Ex9-39干預(yù)也沒有明顯影響（t分別為1.082和1.549，P＞0.05）。（2）wortamannin干預(yù)后NF-M/H磷酸化水平上升（F分別為80.667、235.2，均P＜0.01），而杜拉魯肽干預(yù)后NF-M/H磷酸化水平下降（F分別為 112.667、388.8，均 P＜0.01），杜 拉 魯 肽 和wortamannin存在交互效應(yīng)，D+W組NF-M/H磷酸化水平下降（F交互分別為43.200和16.667）。Ex9-39干預(yù)后NF-M/H磷酸化水平上升（t分別為6.991、6.662，P＜0.05），D+W+E組NF-M/H磷酸化水平高于D+W組（t分別為10.568、10.067，均P＜0.05）。見圖3。

2.4 杜拉魯肽提高p-PI3K（p85）和p-GSK3β（S9）的表達(dá)水平 （1）wortamannin和杜拉魯肽干預(yù)后對細(xì)胞內(nèi)胰島素信號通路相關(guān)蛋白PI3K均沒有明顯影響（F分別為0.110和0.143，均P＞0.05），Ex9-39干預(yù)也沒有明顯影響（t=1.820，P＞0.05）。對GSK3β均沒有明顯影響（F分別為3.900和0.208，均P＞0.05），Ex9-39干預(yù)也沒有明顯影響（t=0.643，P＞0.05）。（2）wortamannin干預(yù)后p-PI3K和p-GSK3β水平下降（F分別為274.766、49.693，均P＜0.01），而杜拉魯肽干預(yù)后p-PI3K和p-GSK3β水平上升（F分別為 140.187、30.061，均 P＜0.01），杜 拉 魯 肽 和wortamannin存在交互效應(yīng)，D+W組p-PI3K和p-GSK3β水平上升（F交互分別為14.020和13.800，均P＜0.05）。Ex9-39干預(yù)后p-PI3K和p-GSK3β降（t分別為3.326和5.140，均P＜0.05），D+W+E組NFM/H磷酸化水平低于D+W組（t分別為5.410和2.970，均P＜0.05）。見圖4。

Fig.3 The phosphorylation levels of NF-H and NF-M detected by Western blot assay in SH-SY5Y cells圖3 Western blot檢測SH-SY5Y細(xì)胞NF-H/M蛋白及其磷酸化水平

3 討論

Fig.4 The phosphorylation levels of PI3K/GSK3β signaling pathways detected by Western blot assay in SH-SY5Y cells圖4 Western blot檢測SH-SY5Y細(xì)胞PI3K/GSK3β的磷酸化水平

AD是一種慢性神經(jīng)退行性疾病并最終導(dǎo)致患者的癡呆和死亡，伴隨著老齡化的加劇和慢性疾病如糖尿病和高血壓發(fā)病率增加，我國AD絕對患病人數(shù)呈急劇上升趨勢，嚴(yán)重影響老齡人群的健康和生存質(zhì)量，因此預(yù)防和治療AD具有重要意義［13］。然而95%的AD病例屬于散發(fā)型，多種因素如遺傳易感性、代謝改變和環(huán)境因素等可能導(dǎo)致散發(fā)性AD的發(fā)生，盡管在AD的發(fā)病機(jī)制研究方面已取得一些進(jìn)展，特別是發(fā)現(xiàn)Aβ過度產(chǎn)生和聚集可導(dǎo)致AD樣病理改變，然而沒有在此基礎(chǔ)上開發(fā)出有效的治療藥物［14-15］。本研究所用的SH-SY5Y細(xì)胞是人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH的亞型，與神經(jīng)元有某些相似的生理功能，是一種良好的細(xì)胞模型，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性變的疾病研究中［16］。本實(shí)驗(yàn)通過給予SHSY5Y細(xì)胞PI3K抑制劑wortmannin建立AD樣細(xì)胞模型，可以明顯地觀察到過度磷酸化細(xì)胞骨架蛋白Tau和NFs在細(xì)胞內(nèi)的聚集和細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變等類似AD退行性變的病理特點(diǎn)，以此為模型可以觀察治療糖尿病新藥杜拉魯肽的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制，闡明其與AD樣病理改變及PI3K信號通路的關(guān)系，為進(jìn)一步在動物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用提供理論依據(jù)［17］。

GLP-1作為一種腸促胰島素，其相關(guān)藥物如利拉魯肽和艾塞那肽等用于治療2型糖尿病，受到廣泛關(guān)注［18-19］。GLP-1R在腦內(nèi)廣泛存在，在食欲抑制、神經(jīng)元活性的調(diào)節(jié)、海馬神經(jīng)元回路的活性調(diào)節(jié)等過程中有重要作用［20-22］。GLP-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著促進(jìn)神經(jīng)元生長和修復(fù)，減少炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激的神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用［23-24］。但是GLP-1在體內(nèi)很容易被二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidylproteaseⅣ，DPP-4）降解，GLP-1類似物杜拉魯肽的氨基酸序列和分子質(zhì)量有所改變，半衰期延長至48 h，每周注射1次，可促進(jìn)胰島素分泌，降低血糖，保護(hù)胰島β細(xì)胞［25-26］。腦內(nèi) GLP-1通過和 GLP-1R 結(jié)合激活GLP-1信號，與神經(jīng)元的生長、存活，血糖的調(diào)控及學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)［27］。GLP-1R基因缺失的小鼠學(xué)習(xí)能力下降、腦組織糖代謝減弱并伴有神經(jīng)細(xì)胞的抗損傷能力下降，而海馬過表達(dá)GLP-1R以及外源給予GLP-1類似物［Ser(2)］exendin（1-9）可改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、調(diào)節(jié)糖代謝和保護(hù)神經(jīng)的凋亡，提示GLP-1信號在學(xué)習(xí)記憶和葡萄糖穩(wěn)態(tài)（glucose homeostasis）調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用［28］。GLP-1類似物利拉魯肽雖然半衰期為13 h，但需每天給藥，這就限制了GLP-1的腦內(nèi)應(yīng)用。杜拉魯肽對神經(jīng)細(xì)胞的作用鮮見報道［29-30］。本研究顯示，與對照組和wortmannin組相比，杜拉魯肽能提高神經(jīng)細(xì)胞的活力，上調(diào)p-PI3K（p85）和p-GSK3β（S9）信號通路磷酸化水平，并下調(diào)了Tau蛋白pS262、pS396和pS404位點(diǎn)的磷酸化水平和NF-H/M磷酸化水平，表明杜拉魯肽可通過與GLP-1R結(jié)合激活PI3K信號通路相關(guān)分子，改善胰島素信號通路，增加細(xì)胞的糖代謝，影響Tau和神經(jīng)絲蛋白的磷酸化和聚集，對抗神經(jīng)細(xì)胞的退行性變，深入探討其作用和機(jī)制可為AD防治藥物的研究提供新的思路。