陸 苑, 潘 潔, 楊淑婷, 吳 瓊, 劉春花, 李勇軍, 劉 亭

(1.貴州省藥物制劑重點實驗室；2. 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心；3. 貴州醫(yī)科大學藥學院；4. 國家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550004)

艾迪注射液(Aidi injection, ADI)是由斑蝥、人參、黃芪和刺五加組成的中藥復方注射液[1]，屬國家基本藥物，收載于部頒標準，具有清熱解毒、消瘀散結(jié)功能。ADI在晚期惡性腫瘤治療中的療效明顯，可通過發(fā)揮協(xié)同作用來提高腫瘤治療的綜合療效和提升患者生存的質(zhì)量[2]。近年來，有關(guān)ADI與化療藥物聯(lián)合治療肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，多為臨床療效觀察的報道，缺乏基礎(chǔ)研究，有關(guān)其產(chǎn)生協(xié)同作用機制的報道更為少見[2-5]。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (glutathione S-transferases, GSTs;EC 2.5.1.18) 是一種II相代謝酶，是細胞抗損傷、抗癌變和重要的解毒酶系統(tǒng)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，GSTs在HCC組織中具有較高水平的表達，且π亞型 GSTs (GST-π) 與細胞的癌變、腫瘤的形成以及腫瘤的耐藥性有密切關(guān)系[7]。具有親電子特性的氮芥類、蒽環(huán)類、鉑類和烷化劑均是GSTs的底物，GSTs能促使細胞毒性藥物代謝加速，降低化療藥物的細胞毒作用，導致耐藥性的發(fā)生[8-11]。因此，尋找或設(shè)計GSTs抑制劑對于逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，提高腫瘤藥物治療指數(shù)，減少腫瘤患者身體和經(jīng)濟方面的負擔都有著重要的意義。本實驗將考察ADI對HCC大鼠肝功能各項生化指標、肝組織中GSTs酶活性以及GST-π表達的影響，以期從是否抑制GSTs酶活性或表達方面，來研究ADI與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生協(xié)同作用的機制。

1 材料

1.1實驗動物SPF級健康♂ SD大鼠，180～200 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物許可證編號：SCXK (湘) 2014-0011。

1.2藥物及試劑艾迪注射液(貴州益佰制藥有限責任公司，批號20150627，規(guī)格10 mL/支)；大鼠谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20151127)；二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine, DEN)(批號D0516A，純度 >99.0 %)購自大連美侖生物科技有限公司；TRIzol(Invitrogen，批號101004)；Eastep總RNA提取試劑盒(Promega，批號0000197548)；TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix(批號00351597)、SYBR? Premix Ex TaqTMII(批號AK7005)均購自大連寶生物有限公司；GST-π、GAPDH引物由上海英駿有限公司合成；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號20170121)；GST-π抗體(批號gr136981-3)、GAPDH(批號gr136220-9)、羊抗兔IgG(H+L)-HRP(批號gr216930-6)、羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP(批號gr124950-7)，均購自Abcam。

1.3儀器Biomate 3S核酸蛋白紫外測定儀、Fresco 17高速冷凍離心機(美國Thermo公司)；Trans-Blot Turbo蛋白快速轉(zhuǎn)印儀、Mini Trans-blot Cell垂直電泳槽、CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(英國Syngene公司)；EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；TGrinder電動組織研磨器(北京天根生化科技有限公司)。

2 方法

2.1HCC模型建立根據(jù)文獻報道的改良法建立原發(fā)性肝癌大鼠模型[12-13]。26只♂ SD大鼠，其中20只進行造模(大鼠自由飲用含95 mg·L-1DEN的溶液，每天更換1次，連續(xù)飲用30 d后，改飲用煮沸自來水30 d，再繼續(xù)飲用含95 mg·L-1的DEN溶液70 d)，造模結(jié)束后存活18只，造模結(jié)束后隨機挑選6只HCC大鼠進行病理學檢查。其余12只HCC大鼠和6只正常大鼠進行生化指標、GSTs酶活性和GST-π表達的測定。

2.2一般狀況評估和病理學檢查造模過程中，觀察大鼠的狀況。造模結(jié)束后，解剖大鼠，拍照。然后，取肝臟典型的病變組織放入4%多聚甲醛溶液，固定24～48 h，然后轉(zhuǎn)入70%乙醇脫水長期保存。收集的標本于貴州醫(yī)科大學病理教研室進行石蠟包埋、切片、HE染色，在光學顯微鏡下觀察和攝影。

2.3動物分組和給藥將HCC模型大鼠分成兩組，與同批次正常大鼠共計3組進行實驗，每組6只。分別是正常組(腹腔注射生理鹽水10 mL·kg-1，每日1次，連續(xù)給藥14 d)、模型組(腹腔注射生理鹽水10 mL·kg-1，每日1次，連續(xù)給藥14 d)、模型-ADI組(腹腔注射ADI 10 mL·kg-1，每日1次，連續(xù)給藥14 d)，在給藥期間飲用滅菌自來水和正常飼料。大鼠末次給藥后，禁食16 h，股動脈取血，全血測定生化指標；剪開腹腔取其肝臟，用預冷的生理鹽水將肝臟的血沖洗干凈。3組大鼠的一部分肝臟組織進行GSTs活性測定實驗。

小心分離模型組大鼠的癌旁組織(para-cancerous tissue, PCT)和癌灶組織(cancerous tissue, CT)，以及正常組大鼠肝臟組織(normal liver tissue, NLT)。得到5組樣品，分別為模型-ADI組大鼠的癌旁組織(ADI-PCT)、模型-ADI組大鼠的癌灶組織(ADI-CT)、模型組大鼠的癌旁組織(Control-PCT)、模型組大鼠的癌灶組織(Control-CT)和正常組肝臟組織(NLT)，進行qRT-PCR和Western blot實驗。

2.4生化指標分離血清后，進行生化指標谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT) 、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、總膽紅素(total bilirubin, TBil)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)檢查，在貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科生化分析儀進行檢測。

2.5GSTs活性檢測GSTs具有催化谷胱甘肽(glutathione, GSH)與1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloor-2,4-dinitrobenzeen, CDNB)結(jié)合的能力，本實驗按照GSTs活性檢測試劑盒說明書操作，通過紫外/可見分光光度計檢測GSH與CDNB的結(jié)合物在412 nm下的OD值，進而計算肝組織中GSTs活力的大小。組織中GSTs活力單位為kU·g-1Pro，即每毫克組織蛋白在37℃反應(yīng)1 min扣除非酶促反應(yīng)，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol·L-1為1個酶活力單位。GSH濃度降低越多則GST活力越大。

2.6qRT-PCR檢測GST-πmRNA水平取肝臟約20 mg，加入1 ml TRIzol試劑勻漿，并按說明書，用Eastep總RNA提取試劑盒提取純化肝臟總RNA。利用核酸蛋白紫外測定儀檢測RNA樣品濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA樣品的完整性。取RNA 2.0 μg按說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。20 μL qRT-PCR反應(yīng)體系包括: 2.0 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物，上、下游引物(10 μmol·L-1) 各0.4 μL，SYBR Premix Ex Taq II (2×)10 μL。用GAPDH作為內(nèi)參基因。qRT-PCR引物序列如下：GAPDH上游引物 5′-TATGCCAACACCCTCAGTGC-3′，下游引物 5′-CTGCTTGCTGGTACTCATCC-3′；GST-π上游引物 5′-TGCTATTCTCTGCTCCTGTCTG-3′，下游引物5′-CAAACCCTACTGCAACTGTG-3′。PCR擴增程序為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后繪制熔解曲線。用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。

2.7Westernblot檢測GST-π蛋白的表達取約100 mg肝組織用RIPA裂解液于冰上勻漿，制備總蛋白提取液，并按BCA蛋白定量試劑盒說明書操作，測定蛋白濃度。各組取等量總蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將目的條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，用5%牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉，再分別加入一抗(GST-π抗體1 ∶5 000、GAPDH抗體1 ∶5 000)，在室溫下孵育2 h，用1×TBST緩沖液漂洗3次。再與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的抗鼠(1 ∶10 000)或抗兔(1 ∶20 000)二抗孵育1 h。二抗孵育結(jié)束后，用1×TBST緩沖液漂洗3次。ECL顯色，于凝膠成像儀中掃描成像，使用Quantity one凝膠圖像分析軟件進行灰度值分析。

Tab 1 Liver function indicators of three

**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel

3 結(jié)果

3.1一般狀況評估和病理學檢查實驗過程中，模型組大鼠開始出現(xiàn)不同程度的豎毛、精神萎靡、活動減少、食欲不振、消化不良等表現(xiàn)。解剖大鼠，模型組肝臟色澤晦暗，肝表面布滿粗顆粒結(jié)節(jié)，并可見明顯癌結(jié)節(jié)突起，癌結(jié)節(jié)較周圍組織發(fā)白，有的癌結(jié)節(jié)伴有出血性壞死，呈暗紫色(Fig 1)。Fig 2病理學檢查顯示，模型組大鼠肝組織可見部分肝細胞輕度水腫，HCC形成，癌細胞異型性明顯、核分裂像多見。

Fig 1 Livers of normal group and HCC model group

Fig 2 HE staining of tissue sections(×200)

3.2ADI對肝癌大鼠生化指標的影響與正常組比較，模型組ALT、AST、TBil、ALP水平明顯升高(P<0.01)，表明模型大鼠肝功能嚴重受損。與模型組比較，模型-ADI組ALT、AST、TBil、ALP均明顯降低(P<0.01)，提示ADI對肝功能具有明顯的保護作用(Tab 1)。

3.3ADI對GSTs活性的影響與正常組比較，模型組GSTs活性明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，模型-ADI組GSTs活性明顯降低(P<0.05)，說明ADI可以降低HCC大鼠肝臟中GSTs活性(Tab 2)。

Tab 2 Activity of GSTs in different

**P<0.01vsnormal;#P<0.05vsmodel

3.4ADI對肝臟GST-πmRNA表達的影響各組樣本的總RNA的260/280值在1.86～1.95之間，28S條帶灰度值也大約是18S條帶灰度值的2倍，說明提取到的總RNA適用于后續(xù)qRT-PCR實驗。GST-π mRNA水平檢測結(jié)果見Fig 3。與NLT比較，GST-π在HCC模型大鼠PCT和CT中表達上調(diào)，且差異具有顯著性(P<0.01)；GST-π mRNA表達強度的順序是：NLT

3.5ADI對肝臟GST-π蛋白表達的影響如Fig 4所示，與NLT比較，GST-π在HCC模型大鼠PCT和CT中表達上調(diào)，且差異具有顯著性(P<0.01)。ADI下調(diào)HCC大鼠肝臟中CT的GST-π表達(P<0.01)。

4 討論

DEN是一種化學致癌劑，對肝臟有明顯的親和性，使用其誘發(fā)大鼠HCC模型，因其誘發(fā)癌變的整個過程與人類肝癌發(fā)生過程(肝炎→肝硬化→肝癌)十分相似，且誘癌成功率高，被廣泛用于制作肝癌大鼠模型[14]。由于♂大鼠較♀大鼠對化學誘導劑有較高敏感性[15]，因此選擇♂大鼠進行實驗。實驗過程中，采用長期小劑量間斷給予DEN喂養(yǎng)SD大鼠，其優(yōu)點為：① 采用間斷給藥，可以緩解藥物對肝細胞的毒性損害，減少DEN連續(xù)給予對大鼠肝臟的損傷，可以降低大鼠死亡率；② 該方法操作簡單方便，95 mg·L-1DEN自由喂養(yǎng)，與傳統(tǒng)灌胃或腹腔注射相比，操作方法非常簡便，可以避免長期灌胃或腹腔注射對大鼠造成的損傷。臨床上，肝癌確診的“金標準”是病理組織學檢查，本實驗HE染色結(jié)果表明HCC造模成功。

Fig 3 mRNA expression of GST-π in livers of n=6)

**P<0.01vscontrol-CT;#P<0.05,##P<0.01vsNLT

Fig 4 Protein expression of GST-π in livers of n=6)

**P<0.01vscontrol-CT;##P<0.01vsNLT

根據(jù)藥品說明書，ADI一次使用劑量為50～100 mL，每天1次。標準體重60 kg以100 mL給藥量計算，人的單位體重ADI給藥劑量為1.67 mL·kg-1。若按單位體重的劑量來算，大鼠的等效劑量相當于人的6.3倍。因此，大鼠的給藥劑量為1.67 mL·kg-1×6.3 = 10.5 mL·kg-1。為了實際給藥方便，我們按照10 mL·kg-1給藥劑量給予大鼠ADI，且10 mL·kg-1給藥體積未超過大鼠的最大耐受體積(20 mL·kg-1)。臨床上，ADI視病情使用10～30 d為1個療程。結(jié)合ADI臨床實際使用情況以及實驗操作方便，我們考察了連續(xù)給予大鼠ADI 14 d(每天1次，10 mL·kg-1)后對肝功能和GSTs的影響。

GST-π屬于GSTs家族中的一員，在細胞解毒方面起著關(guān)鍵作用。GST-π可使抗腫瘤藥物轉(zhuǎn)化、代謝加快，細胞內(nèi)有效藥物濃度持續(xù)時間縮短，使藥物在靶部位的積蓄量迅速減少，降低藥效。GST-π陽性表達的腫瘤細胞主要對烷化劑、鉑類、絲裂霉素類等藥物耐藥[10-11]。因此，通過下調(diào)GST-π可有效逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性。本實驗測定了正常組、模型組和模型-ADI組大鼠肝臟組織中GSTs的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝臟中GSTs活性明顯高于正常組；ADI可降低肝癌組織中GSTs活性，并且ADI可降低癌灶組織中GST-π表達，但對癌旁組織中GST-π表達無明顯影響。以上結(jié)果表明，ADI具有降低肝癌組織GSTs活性的功能，這種功能可能與其降低GST π的表達有關(guān)。與此同時，ADI可明顯降低HCC大鼠的ALT、AST、TBil、ALP，提示ADI還具有肝功能保護作用。

綜上所述，ADI可降低HCC大鼠肝臟中GST-π的表達，從而降低GSTs酶活性，這對逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性具有重要意義，這也可能是ADI治療HCC發(fā)揮協(xié)同作用的重要作用機制。