楊玉玲，王照巖，楊志一，李洪利，尹崇高，劉雨清

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1.臨床醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室、2.醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心、3.護(hù)理學(xué)院，山東 濰坊 261053)

最近研究表明，microRNAs在惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中所起的作用是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程[1]，在此過(guò)程中涉及多種通路，如JAK/STAT、PI3K/Akt/mTOR、PI3K/Akt/MMP途徑，其中PI3K/Akt通路與多種腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)，如胰腺癌[2]、肝癌[3]等。先前研究表明，miR-125a-5p靶向調(diào)控GRB相關(guān)蛋白2(GRB-associated binding protein 2，GAB2)影響乳腺癌的遷移能力[4]，并且也證明GAB2通過(guò)PI3K/Akt/MMP通路，促進(jìn)乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移[5]，但是關(guān)于miR-125a-5p是否通過(guò)PI3K/Akt/MMP途徑抑制乳腺的侵襲與轉(zhuǎn)移，目前尚未有研究。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)改變miR-125a-5p和GAB2在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，探討miR-125a-5p抑制乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病例資料 收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2012-2017年的乳腺癌組織及其癌旁相對(duì)正常組織(>5 cm)各85例作為研究對(duì)象。這些病理組織已經(jīng)確診為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，患者均為女性，術(shù)前未經(jīng)過(guò)任何化療和放療，年齡30～70歲，臨床資料完整。所有85例乳腺癌患者均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2試劑與細(xì)胞株 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2、MMP-9、β-actin抗體，均購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；質(zhì)粒均由吉?jiǎng)P基因構(gòu)建合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit、PCR試劑盒SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit，均購(gòu)自TaRaKa公司；Transwell小室購(gòu)自Corning公司；Lipofectamine 2000購(gòu)于Invitrogen公司。乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231(MDA231)、MCF-7購(gòu)自ATCC。

1.1.3儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司)，雙垂直電泳槽(Bio-Rad公司)，Bio-Tek酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 參照文獻(xiàn)[6]操作，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒濃度0.761 9 g·L-1，轉(zhuǎn)染48 h，分組如下：① MDA231/NC(negative control)組：轉(zhuǎn)入過(guò)表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒；② MDA231/miR-125a-5p組：轉(zhuǎn)入miR-125a-5p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；③ MDA231/Con+miR-125a-5p組：共轉(zhuǎn)染GAB2過(guò)表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒和miR-125a-5p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；④ MDA231/GAB2+miR-125a-5p：共轉(zhuǎn)染GAB2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和miR-125a-5p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.2Western blot實(shí)驗(yàn) 各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞加入裂解液，提取蛋白。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別孵育一抗、二抗。所用抗體濃度：β-actin(1 ∶1 000)，MMP-2、MMP-9、p-Akt、Akt(1 ∶500)。所得的條帶用ImageJ進(jìn)行灰度值掃描。

1.2.3熒光定量PCR檢測(cè) 提取MCF-10A、MDA231、MCF-7細(xì)胞以及85例組織的RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步進(jìn)行qRT-PCR。miR-125a-5p的上游引物：5′-AGCGCGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′，下游引物:5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′,以U6作為內(nèi)參，莖 環(huán) 結(jié) 構(gòu): GTCGTATCCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCACAG。進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s 1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。共有85例病理組織，將所得的結(jié)果分為miR-125a-5p高表達(dá)組(高于中位數(shù))和miR-125a-5p低表達(dá)組(低于中位數(shù))。

1.2.4Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后48 h，處理細(xì)胞，取3.5×104個(gè)細(xì)胞滴入上室，下室加入500 μL胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定20 min，Giemsa染色40 min，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。隨機(jī)取 5 個(gè)視野進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù) 3 次。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料之間的比較采用χ2檢驗(yàn)，多組比較使用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1miR-125a-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)85例病理組織中miR-125a-5p的表達(dá)量。Tab 1結(jié)果顯示，miR-125a-5p低表達(dá)者為51例(低于中位數(shù))，高表達(dá)者34例(高于中位數(shù))。其中，miR-125a-5p的表達(dá)水平與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、雌激素受體(ER)和組織學(xué)分期有關(guān)(P<0.05)，而與其他病理參數(shù)，如年齡、腫瘤大小、孕激素受體(PR)無(wú)關(guān)。

Tab 1 Relationship between miR-125a-5p expression andclinicopathologic parameters in 85 breast cancer patients

PR: Progesterone receptor;ER: Estrogen receptor.

2.2miR-125a-5p在乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-125a-5p的表達(dá)水平。Fig 1結(jié)果顯示，miR-125a-5p在MDA231和MCF-7細(xì)胞中表達(dá)水平比MCF-10A細(xì)胞明顯降低(P<0.05)。

Fig 1 Expression levels of miR-125a-5p in MCF-10,MCF-7 and MDA231 cells n=3)

*P<0.05vsMCF-10A

2.3miR-125a-5p抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲能力Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-125a-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。如Fig 2所示，與MDA231/NC細(xì)胞組相比，用EGF刺激后，MDA231/miR-125a-5p細(xì)胞組穿過(guò)基膜小孔的細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；與MDA231/Con+miR-125a-5p細(xì)胞組相比，MDA231/GAB2+miR-125a-5p細(xì)胞組穿過(guò)基膜小孔的細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)。結(jié)果表明，miR-125a-5p抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。

2.4miR-125a-5p降低Akt的磷酸化水平Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，用EGF刺激后，與MDA231/NC細(xì)胞組相比，MDA231/miR-125a-5p細(xì)胞組p-Akt水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與MDA231/Con+miR-125a-5p細(xì)胞組相比，MDA231/GAB2+miR-125a-5p細(xì)胞組p-Akt水平明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5miR-125a-5p下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)Fig 4的Western blot結(jié)果顯示，用EGF刺激后，與MDA231/NC細(xì)胞組相比，MDA231/miR-125a-5p細(xì)胞組MMP-2和MMP-9的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與MDA231/Con+miR-125a-5p細(xì)胞組相比，MDA231/GAB2+miR-125a-5p細(xì)胞組MMP-2和MMP-9表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，miR-125a-5p下調(diào) MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)。

Fig 2 miR-125a-5p inhibited invasion of

Transfected MDA231 cells were treated with the stimulation of 10 μg·L-1EGF. A: Representative images of penetrated cells with EGF stimulation;B, C: Quantification analysis of Transwell invasion assay on cells.*P<0.05vsMDA231/NC or MDA231/Con+miR-125a-5p.

3 討論

乳腺癌是女性癌癥死亡的首要原因，在其早期階段通常沒(méi)有致命性，但發(fā)生轉(zhuǎn)移后，患者的死亡率將會(huì)升高[7]。因此，研究乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。miRNAs是一類長(zhǎng)約18～25個(gè)的核苷酸序列，它通過(guò)與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)作用，發(fā)揮其功能[8]。近年來(lái)對(duì)于miR-125a-5p的研究更加深入，并且發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p與多種疾病的發(fā)生相關(guān)。Zhu等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p能夠作為評(píng)估非小細(xì)胞性肺癌疾病進(jìn)展和預(yù)后的一種重要指標(biāo)。Banerjee等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p參與炎癥的發(fā)生，影響巨噬細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)有關(guān)，熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p在MDA231和MCF-7細(xì)胞的表達(dá)量明顯下降，Transwell結(jié)果顯示 miR-125a-5p抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。

Fig 3 Expression of miR-125a-5p affected phosphorylation level ofAkt through EGF stimulation n=3)

Transfected MDA231 cells were treated with the stimulation of 10 μg·L-1EGF. Expressions of Akt and p-Akt were detected by Western blot.*P<0.05vsMDA231/NC(+) or MDA231/Con+miR-125a-5p(+).

Fig 4 miR-125a-5p down-regulated expression of

Transfected MDA231 cells were treated with the stimulation of 10 μg·L-1EGF. Expressions of MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blot.*P<0.05vsMDA231/NC(+) or MDA231/Con+miR-125a-5p(+).

先前研究表明，miR-125a-5p可通過(guò)與其靶蛋白GAB2結(jié)合，從而抑制乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，而GAB2可與PI3K作用，進(jìn)而活化Akt，且該信號(hào)通路廣泛存在于細(xì)胞中。Tang等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p可通過(guò)PI3K/Akt/mTOR抑制肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p能夠通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

許多研究表明miR-125a-5p在惡性腫瘤中低表達(dá)，如肝癌[12]、胃癌[13]等。先前的研究結(jié)果提示，miR-125a-5p在惡性腫瘤中主要發(fā)揮抑癌基因的作用。其中，GAB2作為miR-125a-5p的靶蛋白，GAB2與MMP-2和MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)，GAB2可調(diào)控MMP-2和MMP-9的表達(dá)[14]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中，上調(diào)miR-125a-5p的表達(dá)水平可引起MMP-2和MMP-9表達(dá)的下調(diào)[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MDA231/miR-125a-5p細(xì)胞組中MMP-2和MMP-9的表達(dá)量下降，而在MDA231/GAB2+miR-125a-5p細(xì)胞組中，MMP-2和MMP-9表達(dá)量明顯升高。結(jié)果表明，miR-125a-5p下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)。

綜上所述，miR-125a-5p在乳腺癌中低表達(dá)，miR-125a-5p可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，從而抑制乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。這將會(huì)加深對(duì)乳腺癌的研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)是在濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心完成，非常感謝各位老師和同學(xué)的幫助。)