婁 諍，趙肖涯，杜麗君，王大維

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 1. 第二臨床醫(yī)學(xué)院、 2. 生命科學(xué)學(xué)院、3. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

迭香屬多年生草本植物，原產(chǎn)地為地中海沿岸地區(qū)，三國時期傳入我國。作為中藥始載于《本草拾遺》，用于健脾、安神、止痛等。迷迭香的化學(xué)成分主要有酚類、萜類、黃酮類等，其應(yīng)用也越來越廣泛，如食品工業(yè)、香薰保健等。1958年，迷迭香酸(rosmarinic acid,RosA)被分離提純以來，被發(fā)現(xiàn)有廣泛的藥理學(xué)作用，如抗菌、抗腫瘤、神經(jīng)保護、抗抑郁等[1-6]。目前對于大多數(shù)腫瘤的治療主要還是手術(shù)、放射療法、化學(xué)治療。臨床應(yīng)用的化療藥物大多毒副作用大，并逐漸產(chǎn)生耐藥，因此，開發(fā)毒副作用小的有效抗腫瘤藥物非常迫切。文獻報道，RosA對乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤細胞株有較好的抑制作用[4-6]。因此，RosA在抗腫瘤方面可能有較好的前景，但是RosA對人多發(fā)性骨髓瘤ARH-77細胞的作用尚未見報道。本課題以ARH-77細胞為研究對象，探討RosA對其增殖的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1細胞與藥物ARH-77細胞購自上海酶研生物科技有限公司，細胞用含10%胎牛血清、青霉素1×105U·L-1、鏈霉素100 mg·L-1的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。RosA (純度≥98%,HPLC)購自美國Sigma公司。RosA溶于DMSO中，配制成濃度為100 mmol·L-1的儲存液，于4℃避光備用，用時以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋。

1.2試劑胎牛血清購自美國Gemini公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、PMSF、RIPA、caspase-8活性檢測試劑盒，均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR試劑盒購自TaKaRa；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，購自美國BD公司；引物由上海生工生物工程公司合成；抗β-actin、GAPDH、tBid、Fas、活性caspase-9的抗體，均購自英國Abcam公司。

1.3儀器Scientific Varioskan flash多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；FC500流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；實時熒光定量PCR儀(Roche公司)；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(LI-COR公司)。

2 方法

2.1CCK-8法檢測迷迭香酸對ARH-77細胞增殖的抑制作用待ARH-77細胞處于對數(shù)生長期時，將單細胞懸液以每孔1×104個接種于96孔板?？瞻捉M為含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，但沒有細胞。對照組為正常培養(yǎng)細胞，不加藥。實驗組的RosA終濃度分別為10、20、40、80、160、320 μmol·L-1。每組設(shè)置6個平行孔，干預(yù)的時間點分別為12、24、48 h。干預(yù)結(jié)束前1 h，加CCK-8溶液，干預(yù)結(jié)束后，于 450 nm波長檢測吸光度(A450)。細胞生長抑制率= [1 -(實驗組A450-空白組A450)/(對照組A450-空白組A450)]×100%。

2.2流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡取處于對數(shù)生長期的ARH-77細胞，以每孔1×106個接種于6孔板。根據(jù)增殖抑制實驗的結(jié)果，將實驗組設(shè)為3組，RosA的終濃度分別為20、40、80 μmol·L-1，干預(yù)時間為48 h。對照組為正常培養(yǎng)的細胞。干預(yù)結(jié)束后，離心收集細胞，用冷PBS洗滌2次，以100 μL 1×Binding buffer重懸細胞，每管加入FITC Annexin V 5 μL，室溫避光孵育15 min，檢測前每管加入PI 5 μL，1 h內(nèi)檢測完畢。

2.3qPCR檢測凋亡相關(guān)基因mRNA的表達細胞培養(yǎng)、分組和干預(yù)同“2.2”。采用TRIzol法提取細胞總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后以cDNA進行熒光定量PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參。PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性，5 min；95℃，10 s；58℃，30 s； 40個循環(huán)；72℃，10 min。熔解曲線初始溫度為60℃，每隔30 s升高0.5℃，至95℃結(jié)束。實驗組的目的基因相對于對照組的表達量，以2-△△Ct計算得出?！鳌鰿t = (Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。所用引物序列見Tab 1。

2.4分光光度法檢測caspase-8的活性細胞培養(yǎng)、分組和干預(yù)同“2.2”。冰上裂解細胞提取蛋白，測蛋白濃度后，使蛋白濃度在1～3 g·L-1范圍內(nèi)，按照試劑盒說明書加入Ac-IETD-pNA，于37℃孵育1 h，而后于405 nm檢測吸光度。按在37℃ 1 h內(nèi)剪切1 nmol Ac-IETD-pNA產(chǎn)生1 nmol pNA的caspase-8的酶量為1個活力單位。將實驗組與對照組相比，得出實驗組caspase-8的相對活力。

Tab 1 Real-time quantitative PCR primers

2.5Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達細胞培養(yǎng)、分組和干預(yù)同“2.2”。以GAPDH和β-actin為內(nèi)參，目的蛋白為tBid、Fas、活性caspase-3和活性caspase-9。收集細胞后，加入裂解液，冰上充分裂解后，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，加入5×上樣緩沖液， 100℃ 10 min使充分變性。進行SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)。封閉2 h后，加入相應(yīng)的一抗4℃孵育過夜。TBST洗滌3次后，加入二抗，于室溫孵育2 h，TBST再次洗滌3次后，于紅外激光成像系統(tǒng)中掃描顯影。用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值，計算目的蛋白的灰度值與相應(yīng)的內(nèi)參條帶的灰度值的比值。

3 結(jié)果

3.1RosA對ARH-77細胞增殖的抑制作用如Fig 1所示，RosA(40～320 μmol·L-1)作用12～48 h可明顯抑制ARH-77細胞的增殖，并且呈時間和劑量依賴性。

Fig 1 Inhibitory effect of RosA on proliferation

Tab 2 Apoptotic rates of ARH-77 cells induced by

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.2RosA對ARH-77細胞凋亡的影響如Fig 2、Tab 2所示，RosA(20、40、80 μmol·L-1)均能明顯誘導(dǎo)ARH-77細胞凋亡，且均以早期凋亡為主(P<0.01)。

Fig 2 FCM results of RosA induced apoptosis in ARH-77 cells

3.3RosA對ARH-77細胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達的影響如Fig 3所示，與對照組相比，caspase-8 mRNA表達在RosA(20、40、80 μmol·L-1)組均明顯上調(diào)，且具有一定的劑量依賴性；RosA(40、80 μmol·L-1)組中caspase-9 mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.01,P<0.05)；而Fas mRNA表達雖然隨著RosA濃度的升高而升高，但僅RosA 80 μmol·L-1組與對照組比較差異有顯著性(P<0.01)。

Fig 3 Effects of RosA on mRNA expression of Fas,caspase-8 and caspase-9 in ARH-77

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.4RosA對ARH-77細胞caspase-8活性的影響如Fig 4所示，ARH-77細胞caspase-8的活性隨著RosA濃度的升高而升高，但是與對照組相比，僅RosA 80 μmol·L-1組差異有顯著性。

Fig 4 Effect of RosA on the activity of caspase-8

**P<0.01vscontrol group

3.5RosA對ARH-77細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響如Fig 5所示，與對照組相比，RosA(20、40、80 μmol·L-1)組活性caspase-3、caspase-9的水平均明顯升高(P<0.01)，且具有一定程度的劑量依賴性；RosA(40、80 μmol·L-1)組tBid表達明顯上升(P<0.01)；Fas在RosA 80 μmol·L-1組的表達明顯升高(P<0.01)。

4 討論

多發(fā)性骨髓瘤是以骨髓中漿細胞大量異常增殖為特征的一種血液系統(tǒng)常見惡性腫瘤，老年人多發(fā)，近年來發(fā)病率逐漸上升，且由于我國人口老齡化日益嚴(yán)重，此病對我國老年人健康的影響不容忽視。雖然目前針對多發(fā)性骨髓瘤的治療手段較多，但仍無法治愈?；颊吣挲g較高，對化療藥物的副作用難以忍受，自體干細胞移植療法也只是使3%～10%的患者超過10年生存期[7]。因此，開發(fā)高效且毒副作用小的藥物較為迫切。本研究的結(jié)果顯示，RosA對人多發(fā)性骨髓瘤ARH-77細胞的增殖有較為明顯的抑制作用，且在一定范圍內(nèi)，呈時間和劑量依賴性。Annexin V-FITC/PI雙染法檢測凋亡的結(jié)果顯示，RosA主要引起ARH-77細胞的早期凋亡。由此推斷，RosA抑制ARH-77細胞增殖的原因是誘導(dǎo)了早期凋亡。

Fig 5 Effects of RosA on the expression of caspase-9,caspase-3,tBid and Fas protein in ARH-77

**P<0.01vscontrol group

由于凋亡不引起機體產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)，所以成為抗腫瘤藥物研究的熱點。文獻報道，RosA衍生物可以通過PI3K/Akt和p38 MAPK信號通路，誘導(dǎo)胃癌MGC-803細胞凋亡[8]。本研究結(jié)果顯示，RosA可上調(diào)ARH-77細胞Fas的mRNA和蛋白水平。Fas又稱為CD95，是凋亡的死亡受體途徑的發(fā)起者。它可與其配體FasL結(jié)合后發(fā)生三聚化，進而其胞內(nèi)段的死亡結(jié)構(gòu)域構(gòu)象改變，與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的C端結(jié)合，而后者的N端可以通過死亡效應(yīng)域募集procaspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體[9]。隨著死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體的形成，局部procaspase-8的濃度升高，procaspase-8自我催化為有活性的caspase-8。caspase-8可以催化下游的caspase，導(dǎo)致級聯(lián)反應(yīng)，使細胞凋亡[10-11]。caspase-8還可以將胞質(zhì)內(nèi)無活性的Bid切割成促凋亡作用很強的tBid。tBid可以通過直接結(jié)合而激活Bax和Bak，也可以通過抑制Bcl-2而間接激活Bax/Bak[12-13]。Bax/Bak在線粒體膜發(fā)生寡聚化形成孔道，使線粒體內(nèi)容物釋放，導(dǎo)致caspase-9的激活，進一步引發(fā)線粒體途徑的凋亡[14-15]。本研究結(jié)果顯示，RosA可使ARH-77細胞中tBid和活性caspase-9的蛋白水平明顯升高，caspase-8的活性也明顯升高。由此推測，RosA誘導(dǎo)了ARH-77細胞凋亡的死亡受體途徑，也許由tBid又引發(fā)了線粒體途徑。

綜上所述，RosA誘導(dǎo)早期凋亡，抑制了ARH-77細胞增殖，其機制可能由于RosA上調(diào)了Fas的表達，引發(fā)了凋亡的死亡受體通路，其間發(fā)生了caspase-8的活化，進而使Bid被切割成活性較高的tBid?；蛟S由于tBid而誘發(fā)了線粒體凋亡途徑，使caspase-9活化。死亡受體途徑和線粒體途徑共同參與了RosA誘導(dǎo)的ARH-77細胞凋亡。然而本課題中，caspase-9的活化是否僅依賴于tBid的誘發(fā)，以及caspase-9活化和caspase-8活化的相互關(guān)系等，有待于進一步的研究，為RosA治療多發(fā)性骨髓瘤提供更加詳實的理論依據(jù)。

(致謝：本實驗于浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究所完成，感謝研究所的老師和同學(xué)的指導(dǎo)和幫助。)