楊軍國(guó)，宋振碩，陳 鍵，王麗麗，林清霞，陳 林

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015)

茶多糖(Tea Polysaccharides，TPs)系茶葉中具有生物學(xué)活性的復(fù)合多糖的簡(jiǎn)稱(chēng)。茶多糖具有多種保健功效，諸如抗氧化、降血糖、降血脂、抗血栓、抗癌、抗輻射、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等[1-3]，其抗氧化和降血糖尤為突出。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體系明確證實(shí)，茶多糖機(jī)體水平上具有較強(qiáng)的抗氧化活性[4-6]。然而，在以活性氧簇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)等評(píng)價(jià)指標(biāo)的體外抗氧化試驗(yàn)，結(jié)果不一。粗茶多糖清除自由基活性強(qiáng)于純茶多糖，純茶多糖片段清除自由基活性低，乃至不具有清除自由基的活性[7-8]；同等粗茶葉多糖水平，在不同提取方法、原料、自由基種類(lèi)等因素作用下茶葉多糖清除自由基活性表達(dá)也不盡相同[9-10]。由此來(lái)看，茶多糖提取純化的過(guò)程中生物學(xué)活性已經(jīng)發(fā)生了改變，其提取制備過(guò)程中的抗氧化活性表達(dá)評(píng)價(jià)尤為必要。

近年來(lái)，茶多糖在傳統(tǒng)制備方法如酸堿法、熱水浸提法、醇沉法的基礎(chǔ)上，引入超聲波/微波/酶法輔助浸提[11-12]、超臨界流體萃取[13]、膜分離技術(shù)[14]、吸附樹(shù)脂技術(shù)[15]、柱色譜法[16-17]等新型提取純化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了高效、節(jié)能和環(huán)保。前期本課題組研究表明，采用先65%醇洗+后水提的提取制備方式，可制得≥15%含量的粗茶多糖[18-20]。以該粗茶多糖為原料，經(jīng)膜分離結(jié)合DEAE-纖維素52柱色譜純化分級(jí)茶多糖，對(duì)其抗氧化活性表達(dá)予以考察評(píng)價(jià)，以期為茶多糖的純化過(guò)程中生物學(xué)活性變化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

清香烏龍茶系福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所自制；粗茶多糖由大閩食品(漳州)有限公司加工制備(多功能提取罐、95%食用乙醇、碟式分離、反滲透膜濃縮、噴霧干燥塔)；福林酚：北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，純度>97.0%)：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；DEAE-纖維素52：北京索萊寶科技有限公司；羥基自由基試劑盒、超氧陰離子試劑盒、總抗氧化能力試劑盒：南京建成生物工程研究所；鐵氰化鉀：阿拉丁(試劑)上海有限公司；無(wú)水乙醇、蒽酮、濃硫酸、葡萄糖等均為分析純?cè)噭簢?guó)藥集團(tuán)上海試劑有限公司；其余均為色譜純或分析純?cè)噭?/p>

D99-3型分離層析儀：上海青浦滬西儀器廠；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BONA-GM-19反滲透分離實(shí)驗(yàn)機(jī)(10000D和20000D孔徑膜)：濟(jì)南博納生物技術(shù)有限公司；Infinite M多功能微孔板檢測(cè)儀(酶標(biāo)儀)：瑞士Tecan Group Ltd.；ACD-0502-U實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)：重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司；DK-8D型電熱恒溫水浴槽：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHC-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗茶多糖的制備及其膜-纖維素柱色譜分離 以自制清香烏龍茶為原料，每批次10 kg參考楊軍國(guó)[20]的方法并結(jié)合傳統(tǒng)速溶茶浸提工藝，采用先65%醇洗+后水提的制備方式，經(jīng)醇洗、水提、碟式分離、反滲透膜濃縮、噴霧干燥，制得水提粗茶多糖。稱(chēng)取8.50 g該粗茶多糖，溶于1000 mL超純水中，反滲透實(shí)驗(yàn)分離機(jī)于10000D孔徑膜、0.1 MPa壓力下截留分離，截留液再經(jīng)20000 D孔徑膜分離，收集該透過(guò)液1000 mL作為分子量為10000～20000的茶多糖溶液。10000～20000 D的茶多糖溶液上DEAE-纖維素52柱色譜(內(nèi)徑1.0 cm×高度40 cm，1 BV約等于12 mL)，水洗后，依次用濃度為0.10、0.35和0.60 mol·L-1的NaCl溶液梯度洗脫，分部收集，每部分收集100 mL。以10000～20000 D的1000 mL茶多糖溶液作為對(duì)照CK，100 mL各濃度NaCl洗脫多糖液由低到高依次定義為T(mén)Ps-1、TPs-2和TPs-3，分別檢測(cè)其單位體積的理化組分及其抗氧化活性表達(dá)。

1.2.2 DPPH自由基清除率測(cè)定 參考韋獻(xiàn)雅[21]的方法，取不同濃度樣品液1.0 mL于試管中，添加無(wú)水乙醇至3.0 mL，然后再加入0.1 mmol·L-1的DPPH溶液3.0 mL，總體積為6.0 mL，混勻靜置反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處比色測(cè)定吸光值。其中，對(duì)照為相應(yīng)濃度的1.0 mL的NaCl溶液+2.0 mL無(wú)水乙醇與3.0 mL的DPPH溶液靜置反應(yīng)后的吸光度數(shù)值。單位體積(mL)DPPH自由基清除率計(jì)算公式為：

式中：A對(duì)照為未加樣品的DPPH自由基吸光度；A樣品為加入樣品反應(yīng)后的DPPH自由基吸光度。

1.2.3 還原力檢測(cè) 取茶多糖樣品溶液1.0 mL于試管中，依次加入1.0 mL 超純水、2.0 mL的0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1，pH=6.6)和2.0 mL的1%鐵氰化鉀溶液，50℃水浴保溫反應(yīng)20 min，快速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液2.0 mL終止反應(yīng)，然后加入0.1 mL的0.1%氯化鐵溶液顯色，混勻靜置反應(yīng)10 min，于700 nm處檢測(cè)吸光度值，以相應(yīng)濃度的NaCl溶液作陰性對(duì)照。

1.2.4 羥基抑制能力、抗超氧陰離子和總抗氧化能力測(cè)定 采用自由基試劑盒檢測(cè)，按照自由基測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5 茶多糖含量的測(cè)定 采用蒽酮-硫酸法，以無(wú)水葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。吸取蒽酮試劑8.0 mL于25 mL容量瓶中，分別滴入茶多糖溶液1.0 mL，搖勻后沸水加熱3 min，快速冷卻，600 nm處比色測(cè)定，以相應(yīng)濃度的NaCl溶液作為陰性對(duì)照，依據(jù)葡萄糖線性標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算溶液中的茶多糖含量。

1.2.6 茶多酚含量的檢測(cè) 參照國(guó)標(biāo)GB/T 8313-2008中的福林酚法檢測(cè)不同茶多糖溶液中的茶多酚含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 7.5和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。試驗(yàn)結(jié)果描述為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(p<0.05)，大寫(xiě)字母表示差異極顯著(p<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茶多糖溶液的自由基清除活性變化

2.1.1 DPPH自由基清除率 DPPH自由基穩(wěn)定，溶于乙醇溶液呈深紫紅色，其褪色程度可反映樣品對(duì)DPPH的清除率，因而廣泛應(yīng)用于各種植物提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià)。本文以自制粗茶多糖為原料，經(jīng)膜分離和DEAE-纖維素52純化制得各級(jí)茶多糖CK(10000～20000D區(qū)間茶多糖)、TPs-1、TPs-2和TPs-3，研究考察了其單位體積內(nèi)(mL)的DPPH清除活性變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖所示，膜分離制得粗茶多糖CK經(jīng)DEAE-纖維素52分離純化后，DPPH清除活性極顯著降低，不同濃度洗脫制得的分級(jí)茶多糖DPPH清除活性亦有所不同，以TPs-2的DPPH清除活性最強(qiáng)，低濃度NaCl溶液洗脫制得的TPs-1活性最弱，分級(jí)多糖之間呈顯著性差異。綜上所述，茶多糖經(jīng)纖維素柱色譜分級(jí)后，DPPH清除活性進(jìn)一步減弱。

圖1 不同茶多糖樣品的DPPH自由基清除活性變化Fig.1 DPPH scavenging activities of tea polysaccharide fractions

2.1.2 抑制羥基自由基能力 茶多糖樣品的抑制羥自由基能力按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，其每毫升溶液在37℃下反應(yīng)1 min使反應(yīng)體系中H2O2濃度降低1 mmol·L-1為一個(gè)抑制羥自由基能力單位。如圖2所示，不同茶多糖樣品溶液的抑制羥自由基能力變化趨勢(shì)與DPPH清除活性變化基本相同，膜分離茶多糖(CK)經(jīng)纖維素柱色譜分級(jí)后，抑制羥自由基能力極顯著減弱。纖維素柱色譜分級(jí)多糖之間比較來(lái)看，低濃度NaCl溶液(0.10 mol·L-1和0.35 mol·L-1)洗脫的茶多糖抑制羥自由基能力變化未見(jiàn)差異顯著性，TPs-2略高，而高濃度NaCl溶液(0.60 mol·L-1)洗脫得到的茶多糖抑制羥自由基能力極顯著降低。

圖2 不同茶多糖樣品的抑制羥基自由基能力Fig.2 Capacity of tea polysaccharide fractions in inhibiting hydroxyl free radicals

2.1.3 抗超氧陰離子活力變化 不同茶多糖樣品溶液的抗超氧陰離子活力變化按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，在反應(yīng)體系中，每升溶液在37℃下反應(yīng)40 min所抑制的超氧陰離子自由基相當(dāng)于1 mg維生素C所抑制的超氧陰離子自由基的變化值為一個(gè)活力單位。結(jié)果表明，與膜分離制得的粗茶多糖CK相比，纖維素柱色譜分級(jí)后茶多糖抗超氧陰離子活力極顯著降低，且由低到高濃度洗脫得到的分級(jí)茶多糖抗超氧陰離子活力變化逐漸減弱，分級(jí)茶多糖之間呈顯著性差異(圖3)。由此可見(jiàn)，粗茶多糖由膜分離到纖維素柱層析之間，抗超氧陰離子活力變化與清除DPPH和羥基自由基表達(dá)了同樣的趨勢(shì)，呈極顯著性減弱。

2.2 不同茶多糖溶液的總抗氧化活性表達(dá)

2.2.1 總抗氧化能力變化 采用試劑盒法考察不同茶多糖樣品的總抗氧化能力變化，37℃時(shí)，每分鐘每毫升茶多糖樣品溶液使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值每增加0.01時(shí)，為一個(gè)總抗氧化能力單位。結(jié)果表明，粗茶多糖經(jīng)10000～20000D膜分離和DEAE-纖維素52柱色譜分離純化后，總抗氧化能力極顯著減弱(圖4)。纖維素柱色譜分離制得的茶多糖樣品TPs-1、TPs-2和TPs-3中，TPs-2總抗氧化能力最強(qiáng)，TPs-1次之，TPs-3最弱，呈顯著性降低，與清除自由基活性表達(dá)趨勢(shì)基本一致。

圖3 不同茶多糖樣品的抗超氧陰離子活力變化Fig.3 Capacity of tea polysaccharide fractions in inhibiting superoxide anion free radicals

圖4 不同茶多糖樣品的總抗氧化能力表達(dá)Fig.4 Total antioxidative activities of tea polysaccharide fractions

2.2.2 還原力變化 抗氧化劑的還原力變化與其抗氧化活性之間呈正相關(guān)性，采用普魯士藍(lán)法抗氧化劑樣品于700 nm處見(jiàn)最大吸收峰，吸光度數(shù)值的大小變化可反映其還原力的強(qiáng)弱。圖5為分子量10000～20000 D茶多糖(CK)及其相應(yīng)的DEAE-纖維素52柱色譜分級(jí)茶多糖TPs-1、TPs-2和TPs-3的還原力吸光度數(shù)值變化，結(jié)果可知，纖維素柱色譜分級(jí)茶多糖的吸光度值極顯著性降低，表明還原力極顯著減弱，比較來(lái)看，TPs-2還原力最強(qiáng)，TPs-1和TPs-3較弱。與總抗氧化能力(試劑盒法)表達(dá)趨勢(shì)略有差異，TPs-1和TPs-3之間并未見(jiàn)顯著性差異。

圖5 不同茶多糖樣品的還原力變化Fig.5 Reducing powder of tea polysaccharide fractions

2.3 不同茶多糖溶液的組成成分含量

茶多糖樣品的抗氧化活性表達(dá)可歸因于茶多酚、茶多糖等抗氧化活性成分，本文研究分析了不同茶多糖樣品中茶多酚和茶多糖的含量變化，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，從DEAE-纖維素52吸附分離效果來(lái)看，以0.35 mol·L-1的NaCl溶液洗脫得到的TPs-2中茶多糖濃度最高，TPs-1次之，TPs-3最低，而TPs-1、TPs-2和TPs-3中茶多酚含量基本未見(jiàn)差異顯著性變化。膜分離多糖CK尚含有較深的色素，可通過(guò)DEAE-纖維素實(shí)現(xiàn)脫色。比較發(fā)現(xiàn)，膜分離多糖CK及其相應(yīng)纖維素分離多糖TPs-1、TPs-2和TPs-3的茶多糖/茶多酚(濃度值之比)比值分別為4.91、12.34、14.97和8.15，表明茶多糖通過(guò)纖維素柱色譜后進(jìn)一步富集。分級(jí)茶多糖樣品的抗氧化活性表達(dá)與茶多糖和茶多酚密切相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果表明(表1)，總抗氧化能力與茶多糖和茶多酚呈顯著性正相關(guān)，茶多糖的相關(guān)性略高于茶多酚。就清除自由基能力來(lái)說(shuō)，茶多糖和茶多酚與其清除活性變化呈正相關(guān)，其中茶多糖與抑制羥基能力呈顯著性正相關(guān)。總體來(lái)看，隨著茶多糖的進(jìn)一步分級(jí)純化，茶多糖含量變高，抗氧化活性變?nèi)?，且自由基種類(lèi)不同清除活性亦有所不同。

圖6 不同茶多糖樣品的成分含量Fig.6 Chemical compositions of tea polysaccharide fractions

表1 茶多糖樣品成分與抗氧化活性表達(dá)的相關(guān)性分析

注：*表示差異顯著(p<0.05)。

3 討論與結(jié)論

氧化應(yīng)激與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，茶多糖的抗氧化活性研究具有重要的生物學(xué)意義。茶多糖的體外清除自由基試驗(yàn)，具有不同的作用效果。有研究表明粗茶多糖對(duì)羥基和超氧陰離子自由基具有明顯的清除作用，高純度茶多糖則對(duì)該類(lèi)自由基清除能力非常低，幾乎沒(méi)有抗氧化能力[7-8]。本文結(jié)果表明，粗茶多糖經(jīng)膜-纖維素柱色譜分級(jí)后抗氧化能力極顯著減弱，清除自由基效果變差，這與學(xué)者[7-8]給出的結(jié)論基本一致。前期本課題組研究表明，醇沉分級(jí)粗茶多糖的抗氧化活性表達(dá)源于含有的抗氧化組分，呈顯著性正相關(guān)的抗氧化組分為茶多酚，尤其是兒茶素類(lèi)單體EC和EGCG，茶多糖的抗氧化作用效果弱于茶多酚[22-23]。隨著粗茶多糖的分級(jí)純化，茶多酚含量的降低，茶多糖的抗氧化活性表達(dá)與茶多糖含量變化呈顯著性正相關(guān)(表1)，茶多糖本身轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡趸钚员磉_(dá)的主要影響因素。

自由基種類(lèi)是茶多糖抗氧化活性表達(dá)的一個(gè)重要影響因素。苗愛(ài)清等[24]也研究比較了超聲波輔助法與傳統(tǒng)常規(guī)法綠茶提取多糖的抗氧化活性變化，結(jié)果表明超聲波輔助法提取的綠茶多糖DPPH自由基清除能力略有提高，ABTS自由基清除活性差異不大，而亞鐵離子絡(luò)合能力降低，分析認(rèn)為超聲波輔助法提取改變了茶葉多糖的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性。張麗美等[25]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助法提取的茶籽多糖對(duì)羥基及DPPH自由基具有較高的清除活性，卻幾乎沒(méi)有還原能力。李星科[26]等研究表明，與熱水浸提法相比，超聲波輔助提取的信陽(yáng)紅茶多糖對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除活性明顯降低，而對(duì)超氧陰離子自由基清除率差異不大。由此來(lái)看，不同加工方法和自由基種類(lèi)作用下茶多糖的自由基活性表達(dá)也不盡相同。本文研究結(jié)果也表明，纖維素柱色譜分級(jí)茶多糖TPs-2、TPs-1和TPs-3對(duì)DPPH自由基、羥基和超氧陰離子的清除表達(dá)趨勢(shì)也并不相同，DPPH清除率TPs-2>TPs-3>TPs-1，抑制羥基能力TPs-2>TPs-1>TPs-3，抗超氧陰離子活力TPs-1>TPs-2>TPs-3，不同的自由基種類(lèi)茶多糖展現(xiàn)了不同的作用效果。相關(guān)性分析進(jìn)一步表明，茶多糖與抑制羥基能力呈顯著性正相關(guān)，而與DPPH清除率及抗超氧陰離子活力并未有差異相關(guān)性。茶多糖糖鏈龐大，構(gòu)象十分繁雜，其高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)生物學(xué)活性的影響最大，不同加工方法可以改變茶多糖的生物學(xué)活性，其結(jié)構(gòu)亦必然發(fā)生了變化。因此，茶多糖的制備-結(jié)構(gòu)-活性的一體系研究應(yīng)作為今后工作開(kāi)展的進(jìn)一步方向。

綜上所述，粗茶多糖經(jīng)膜分離-纖維素柱色譜法分級(jí)后茶多糖進(jìn)一步富集，抗氧化活性顯著性減弱，隨著茶多酚含量的降低，茶多糖含量成為影響其抗氧化活性表達(dá)的主要因素；另外一方面，自由基種類(lèi)也是影響茶多糖抗氧化活性表達(dá)的重要影響因素，不同自由基種類(lèi)作用效果不盡相同，自由基種類(lèi)對(duì)茶多糖抗氧化活性表達(dá)的介導(dǎo)行為也應(yīng)成為今后工作的重點(diǎn)。