林鄭和，鐘秋生，游小妹，陳志輝，陳常頌，單睿陽，阮其春

(福建省農業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福安 355015)

茶樹原產于熱帶及亞熱帶地區(qū)[1-2]，喜溫畏寒，對低溫比較敏感。近幾年全球氣溫變化不穩(wěn)定，而且茶葉消費區(qū)域不斷擴大，茶園種植面積不斷增多[3]，種植緯度北移。低溫凍害在我國茶樹栽培中易發(fā)常見，在南方地區(qū)(如廣東、福建、浙江等地)特別是倒春寒對茶葉的生產及其經濟效益影響巨大。由于茶樹為多年生木本植物，選育一個良種周期較長，主要是新種質創(chuàng)制、早期的鑒定與開發(fā)利用速度緩慢，以致新品種培育工作滯后。以往茶樹抗寒性的鑒定通常通過生化指標的測定[3-4]，但步驟比較繁瑣。植物葉綠素熒光動力學技術是近年來新興的檢測植物光合作用生理狀況的技術，具有快速、簡便、準確的特點，在植物抗冷性、抗凍性方面也顯示出良好的應用前景，已經在花旗松[5]、玉米[6-7]、長豇豆[8]、水稻[9-10]等作物上得到應用。

典型的快速葉綠素熒光誘導動力學曲線呈現(xiàn)O、J、I、P相[11]。有研究表明，葉綠素熒光誘導動力學曲線是反映光合電子傳遞靈敏指標及子傳遞的還原[12-13]。研究表明，OJ相反映了PSII受體側的還原[11,13]；JI相反映了PQ庫的還原[11,14]；IP相反映了PSI受體側還原的部分，被認為是PSII受體側還原最后的限制速度的一步，其幅度可做為PSI含量的粗略指標[15]。植物逆境下(低溫脅迫)葉片光合速率下降，并引起光能過剩，甚至導致光抑制的發(fā)生及光合機構被破壞[15-16]。低溫敏感型番茄葉片在低溫下顯著影響PSⅡ反應中心和電子傳遞，顯著降低了PSⅡ的活性，而對耐低溫野生番茄PSⅡ活性影響較小[17]。廣玉蘭[18]、小麥[19]等植物在低溫下也得出了類似的結果。低溫下冷敏感品種的西瓜[22]、水稻[23]反應中心、天線系統(tǒng)、光合機構受到傷害較耐冷品種嚴重，然而也有人研究發(fā)現(xiàn)[22]，低溫下各不結球白菜品系光化學效率的差異與電子傳遞的有效性是各品系抗冷性能差異的主要原因之一。Perks等[5]用葉綠素熒光技術檢測花旗松的凍害情況時，F(xiàn)v/Fm變化與針葉的傷害和存活率呈線性關系。也有人認為，葉綠素熒光動力學參數(shù)Fv/Fm與電解質滲透率呈負相關，這也可作為鑒定植物抗寒性強弱的另一個指標[11,15]。

‘白雞冠’為武夷山四大名叢之一，其F1代芽葉奇特，葉色淡綠，葉質較脆，綠中帶白，茶葉顏色與眾不同，但抗寒性較差。有鑒于此，本文利用葉綠素熒光誘導動力學參數(shù)對白雞冠的F1代新品系進行抗寒性篩選鑒定，為茶樹抗寒育種的早期鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015～2016年在福建農林大學資環(huán)學院實驗室完成。試驗選用5個白雞冠雜交創(chuàng)新種質F1代0306F、0306I、0309B、0306C、0306D及黃棪(抗寒、抗旱都較強)，每品種(系)選取生長高度、長勢一致，無病蟲害的扦插苗(10月齡)。

1.2 低溫脅迫方法

將植株葉片用去離子水沖洗、擦凈后，用聚乙烯保鮮膜包裹。將每個品種(系)分為2組，放入智能人工氣候箱(寧波海曙賽福實驗儀器廠)中，一組放置在正常溫度(28℃)下生長，另一組進行低溫(0℃)脅迫處理，兩組光照強度和光照時間都相同，分別為300 μmol·m-2·s-1和12 h·d-1。

1.3 葉綠素熒光參數(shù)的測定

用英國生產的連續(xù)激發(fā)式葉綠素熒光儀(Hansatech Handy PEA Hansatech Instruments Limited，Norfolk，UK)。OJIP曲線是由3400 μmol·m-2·s-1的紅光誘導的，紅光由3個發(fā)光二極管提供(峰值650 nm)，光線集中在葉表均勻地照射在暴露的葉面(4 mm直徑)上。在開始的300 μs，每10 μs讀取數(shù)據(jù)一次。隨著熒光動力學信號變慢，數(shù)據(jù)讀取的時間間隔變長。所有測定都在室溫下進行，植株暗適應3 h后進行測定。每處理6個重復(每個枝條1個葉片為1個重復)，取平均值。

表1 葉綠素熒光(OJIP)參數(shù)及公式

(續(xù)表1)

熒光參數(shù)表示Sm=ECo/RC=Area/(Fm-Fo)電子受體全部還原所需要的能量φPo=TRo/ABS=1-Fo/Fm=Fv/Fm最大量子產量(最大光化學效率)φEo=ETo/ABS=Fv/Fm×(1-VJ)電子傳遞的量子產額ψEo=ETo/TRo=1-VJ將電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA其它電子受體的概率φDo=DIo/ABS=1-φPo=Fo/Fm用于熱耗散的量子比率δRo=REo/ETo=(1-VI)/(1-VJ)電子從還原系統(tǒng)傳遞到PSI電子受體側的效率φRo=REo/ABS=φPo×ψEo×δRoABS/RCPS I末端受體還原的量子產額TRo/RC單位反應中心吸收的光能Fraction of OEC用于還原QA的能量Maximum amplitude of IP phas放氧復合體IP相增加的最大幅度ETo/RC=(Mo/VJ)×ψEo=(Mo/VJ)×(1-VJ)反應中心用于電子傳遞的能量DIo/RC=ABS/RC-TRo/RC單位反應中心耗散的能量ETo/CSo=ABS/CSo×φEo單位面積電子傳遞的量子產額TRo/CSo=ABS/CSo×φPo單位面積捕獲的光能DIo/CSo=ABS/CSo-TRo/CSo單位面積的熱耗散REo/CSo=(REo/ETo)×(ETo/CSo)單位面積PSI電子受體側的電子還原產額RC/CSo=φPo×(ABS/CSo)×(VJ/Mo)單位面積反應中心數(shù)量PIabs=(RC/ABS)×[φPo/(1-φPo)]×[ψo/(1-ψo)]PSI電子受體側末端傳遞的電子數(shù)PItot,abs=(RC/ABS)×[φPo/(1-φPo)]×[ψEo/(1-ψEo)]×[δRo/(1-δRo)]總的性能指數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用excel 2003和DPS V6.55版軟件分析試驗數(shù)據(jù)，利用LSD多重比較法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下新品系OJIP曲線的變化

所有OJIP曲線均呈現(xiàn)典型的多相升起，包含O-J-I-P點。低溫脅迫處理下所有品系的葉片OJIP曲線O點都顯著上升，在P點顯著下降(圖1A，B)，并且低溫對白雞冠F1代新品系O-J-I-P曲線影響差異較大，其中品系0306D的O點最大(圖1B)，0306I的O點最低；而品系0306F的P點最低，黃棪最高，其它的介于其中。

2.2 低溫脅迫下新品系相對可變熒光曲線的變化

圖2A、B、C顯示了任一時間相對可變熒光變量的OJIP曲線及6個低溫處理的新品系(種)與正常處理的OJIP曲線之差(ΔVt)。從差異動力學曲線(圖2C)可見：新品系的0306F、0306D的ΔVt曲線變化尤為明顯，變化差異幅度高于其它品種(系)大。其中來自新品系0306I的ΔVt曲線變化幅度最小(圖2C)。

圖1 低溫脅迫下新品系OJIP曲線的變化Fig.1 Effect of low temperature on average transient chlorophyll a fluorescence(OJIP) of hybrid lines

圖2 低溫脅迫下新品系相對可變熒光曲線的變化Fig.2 Expressions of relative variable fluorescence of Fo (A) and Fm(B): Vt=(Ft-Fo)/(Fm-Fo) and ΔVt(C) on 6replicated low-temp treatment samples and ambient temperature reference

2.3 低溫脅迫下新品系Fo和F300μs之間相對可變熒光曲線的變化

圖3顯示了Fo和F300μs之間相對可變熒光變量(WK)的動力學曲線及6個低溫處理的新品系(品種)與對照處理(常溫處理)的動力學曲線之差(ΔWK)，從差異動力學曲線可見，新品系0306F與0306D的ΔWK的動力學曲線變化明顯高于其它的品系(種)和黃棪。其中黃棪與0309B變化最為不明顯(圖3C)。

圖3 低溫脅迫下新品系Fo和F300μs之間相對可變熒光曲線Fig.3 Expressions of relative variable fluorescence of Fo(A) and F300 μs(B): WK=(Ft-Fo)/(F300μs-Fo) and ΔWK(C) on 6replicated low-temp treatment samples and ambient temperature reference

2.4 低溫脅迫下白雞冠F1代新品系ΔFv與Rfd曲線的變化

圖4顯示的是可變熒光的衰減能力ΔFv(Fm-Ft)與可變熒光下降比率Rfd(ΔFv/Ft)的曲線圖。從圖4可看出，低溫下新品系0306F的ΔFv曲線值最低，0306D次之，而黃棪的ΔFv曲線值最大(圖4A)；而Rfd的曲線也是0306F的最低，0306D次之，而黃棪的Rfd曲線值最大(圖4B)。

圖4 低溫脅迫下新品系ΔFv與Rfd曲線的變化Fig.4 Effect of low temperature on average transient Fv and Rfd:ΔFv=(Fm-Ft) (A) and Rfd=ΔFv/Ft(B)

2.5 低溫脅迫下新品系穩(wěn)態(tài)熒光參數(shù)的變化

圖5顯示的是Fo為初始熒光，F(xiàn)m為最大熒光產量，VI與VJ為I與J點的相對可變熒光。從圖5可看出，低溫脅迫下6個品系(種)的Fo、VI都顯著增加(圖5 A、D)，而Fm、VJ顯著下降(圖5B、C)。從圖5A看出，低溫脅迫下Fo以0306D最大，0306I最低(圖5A)；Fm以0306C、0306F最低，黃棪最高(圖5B)。從圖6 D看出，低溫下VI以0306D、0306F最大。

圖5 低溫脅迫下新品系穩(wěn)態(tài)熒光參數(shù)變化Fig.5 Effect of low temperature on steady state fluorescence parameter of F1 hybrids注：每一點為6次重復的平均值±標準誤，同一點標準誤上(下)字母不同者差異顯著(P<0.05)。下同。

2.6 低溫脅迫下新品系葉片單位橫截面的活性參數(shù)變化

從圖6可看出，低溫下各品系除單位面積吸收光能ABS/CSo顯著增加外，其余比活性參數(shù)為：單位面積PSI電子受體側的電子還原產額(REo/CSo)、單位面積反應中心數(shù)量(RC/CSo)、單位面積電子傳遞的量子產額(ETo/CSo)、單位面積捕獲的光能(TRo/CSo)、PSI電子受體側末端傳遞的電子數(shù)(PItot,ABS)都顯著下降。其中低溫下來自新品系0306D的ABS/CSo最大(圖6 A)，0306F、0306D的REo/CSo、PItot,ABS最小(圖6B、F)，0306F的單位面積捕獲的光能(TRo/CSo)、單位面積電子傳遞的量子產額(ETo/CSo)最小(圖6D、E)。

圖6 低溫脅迫下新品系葉片單位橫截面的活性參數(shù)變化Fig.6 Effect of low temperature on phenomenological fluxes or activities expressed per excited cross section

2.7 低溫脅迫下新品系葉片單位單位PSⅡ反應中心的活性變化

從圖7可看出，低溫下各品系除單位反應中心吸收的光能(ABS/RC)外，其余參數(shù)反應中心用于電子傳遞的能量(ETo/RC)、用于還原QA的能量(TRo/RC)、IP相最大幅度(IP phase)都下降。其中低溫下0306D、0306F的ABS/RC(圖7A)顯著高于其它品系，0306F的TRo/RC、ETo/RC(圖7B、C)值最低，0306D、0306F的IP phase(IP相最大幅度)(圖7D)也最低。

2.8 低溫脅迫下新品系葉片單位面積熱耗散參數(shù)變化

從圖8可看出，低溫下各品系熱耗散參數(shù)：單位面積的熱耗散(DIo/CSo)、單位反應中心耗散的能量(DIo/RC)、用于熱耗散的量子產額比率(DIo/ABS)都顯著增加。其中低溫下0306D、0306F的DIo/CSo、DIo/ABS、DIo/RC(圖8A、B、C)都顯著大于其它品系，0306I的DIo/CSo、DIo/ABS、DIo/RC(圖8A、B、C)都顯著低于其它品系。ETo/TRo為電子傳遞鏈中超過QA的其它電子受體的概率，圖8D顯示低溫下來自黃棪與0309B的ETo/TRo最大。

2.9 低溫脅迫下新品系葉片量子產額或者分配比例的變化

從圖 9可看出，低溫下各品系的電子傳遞的量子產額(ETo/ABS)、PS I末端受體還原的量子產額(REo/ABS)、標準化后OJIP曲線和F=Fm 間的面積或者總的電子載體(Sm)、最大光化學效率(Fv/Fm)、電子從還原系統(tǒng)傳遞到PS I電子受體側的效率(REo/ETo)的值都顯著下降，其中低溫下來自0306F、0306D的ETo/ABS、REo/ABS、Sm、Fv/Fm的值最低(圖9A、B、C、D、F)。低溫下放氧復合體(OEC)參數(shù)以0306F、0306D為最大(圖9D)。

圖7 低溫脅迫下新品系葉片單位PSⅡ反應中心的活性變化Fig.7 Effect of low temperature on specific fluxes or activities expressed per reaction center (RC)

圖8 低溫脅迫下新品系葉片單位面積熱耗散參數(shù)變化Fig.8 Effect of low temperature on energy dissipation

3 討論

目前鑒定植物耐寒性的方法較多，其中應用較多、較為準確的是生理生化數(shù)據(jù)分析。但是該方法樣品篩選耗時長，所以評價低溫對植物的影響仍是較為繁瑣的。葉綠素熒光誘導動力學是利用植物逆境下所發(fā)出的具有豐富光合作用信息熒光信號，來判定其其葉片PS II受損傷程度，不具有破壞性，因此成為植物逆境(抗寒性)篩選與鑒定的有效方法之一[23-24]。已經在花旗松[5]、玉米[6-7]、長豇豆[8]、水稻[9]、小麥[19]、西瓜[20]等作物上得到應用。

植物在正常生長的環(huán)境下，葉片所發(fā)射的熒光大部分來自PS II中的葉綠素a，葉綠素吸收的光能主要有進行光合作用、熒光形式發(fā)射耗散以及轉變成熱能散失等作用[25-26]，而這三者之間存在此消彼長的競爭關系。本研究結果表明，低溫下新品系0306D的Fo增加最大(圖5A)，可能是0306D葉片的PS II反應中心出現(xiàn)更為嚴重失活或不易逆轉的破壞，也可能是葉片類囊體膜受到更為嚴重的損傷。這與茶樹越低濃度鉀處理[27]、越低濃度的磷處理[26]時Fo增加越大的結果相一致。本研究還表明，低溫下ΔFv、Rfd以來自0306F、0306D較其它品系低(圖4A、B)，說明可能是0306F、0306D的光合器官受傷害程度較其它品系大。Fv/Fm是PSII反應中心的最大光能轉換效率，是植物抗寒性的主要敏感指標，其值越低可能是光抑制及PSⅡ損害越大。本研究還發(fā)現(xiàn)，低溫下Fv/Fm來自0306D、0306F較其它品系低，說明可能是0306D、0306F的PS II損害較大。Fv/Fm值降低的程度與該品種的抗冷性之間呈現(xiàn)較好的相關性[29]，已經用于玉米[6]、花旗松[5]、長豇豆[8]等許多種植物的抗寒性鑒定中。

圖9 低溫脅迫下新品系葉片量子產額或者分配比例的變化Fig.9 Effect of low temperature on yields or flux ratios and derived parameters

典型的快速葉綠素熒光誘導動力學曲線呈現(xiàn)O、J、I、P相[10]，葉綠素熒光誘導動力學曲線的J點、I點和IP相分別與QA、質體醌及PS I電子受體側末端接受體的還原狀態(tài)有關[12]。本試驗發(fā)現(xiàn)低溫下來自0306D曲線的O點增加最大(圖1 B)，來自0306F的P點最低(圖1B)，來自0306D、0306F的IP相最大幅度下降最大(圖7 D)，意味著PS II的受體側變得更還原，而PSⅠ的受體側變得更氧化。本試驗還發(fā)現(xiàn)低溫下來自0306F、0306D的相對可變熒光變量(ΔVK、ΔWK)變化幅度較其它品系大(圖2 C，圖3 C)，拐點較為明顯。這在缺氮豇豆[10]、缺磷茶樹[28]、缺鉀茶樹[27]上也有相類似的報道。

Sm、φEo、ψo等參數(shù)主要反應了PSⅡ受體側的變化，大豆低溫脅迫下導致φEo、ψo下降[30]。本試驗發(fā)現(xiàn)低溫下0306F、0306D的Sm較其它品系高(圖9C)，而φEo(圖9A)、ψo(圖8D)明顯低于其它品系。說明0306F、0306D品系最大光化學效率(φPo)下降較大(圖9D)，同時，PSⅡ受體側的電子傳遞體(Sm)減少最多(圖9C)，從而導致捕獲的光能把電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA-的電子受體概率(φEo)，對QA-的累積更多。低溫比較敏感品種，電子受體的概率(φEo)的下降更多，使得更多的光能用來還原QA。

本試驗還表明，低溫下0306F、0306D反應中心比活性參數(shù)REo/CSo(圖6B)下降較其它品系大、單位反應中心吸收的光能ABS/RC(圖7A)增加的較其它品系大，單位面積熱耗散DIo/CSo、DIo/RC、DIo/ABS(圖8A、B、C)顯著增加，較其它品系大。說明茶樹各品系低溫脅迫后都啟動了相應的防御機制，其中品系0306F、0306D葉片中更多的過剩激發(fā)能得以及時耗散，用來還原QA的激發(fā)能(TRo/RC)，從而更好的消耗掉葉片中過剩的激發(fā)能。此外，植物吸收過剩的光能也可能引起1O2和還原性活性氧的產生，對植物細胞結構和光合器產生傷害[31-32]。實際上已有研究表明，發(fā)生在PSII供體側和受體側的光抑制傷害可增加活性氧的產生[33]。性能指數(shù)PItot,ABS反映植物光合機構的狀態(tài)[34]，本研究表明，低溫下0306F、0306D的PItot,ABS下降最大(圖6F)，說明光合機構受到嚴重的影響。

總之，研究表明，白雞冠F1代新品系0306F、0306D對低溫更為敏感。低溫使得0306F、0306D的PSII損傷較其它品系嚴重，導致整個電子傳遞鏈嚴重受阻，還通過增強能耗散以保護光合器和細胞結構產生傷害。