劉 鑫 ，朱 丹 ，牛廣財 *，魏文毅 ，張 琪 ，樊秋元

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

藍(lán)莓果實中含有碳水化合物、纖維素、半纖維素、脂肪及蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，鈣、鐵、鋅和維生素等微量營養(yǎng)素，以及多種功能因子，具有抗氧化、改善視力、預(yù)防心血管疾病、保肝等功效。藍(lán)莓酵素含有豐富的超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，以及酚類、維生素、黃酮類等次生謝產(chǎn)物，具有抗炎抑菌、凈化血液、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等作用。為此以藍(lán)莓為原料，采用酵母菌作為發(fā)酵菌種，制備一種蛋白酶活力與SOD酶活力較高的功能性酵素產(chǎn)品，為生產(chǎn)實踐提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓：黑龍江省大慶市農(nóng)貿(mào)市場；葡萄酒專用高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：市售；Pectinex XXL果膠酶 （酶活 14 000 U）：Novozyme諾維信公司；福林酚試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SOD酶活力檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

手持式折光儀：河北潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司；電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；EX324電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；TD5Z低速平衡離心機(jī)：金壇市城西春蘭試驗儀器廠；UV-1100紫外-可見分光光度計：上海凌析達(dá)儀器；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 工藝流程與操作要點

藍(lán)莓→清洗、破碎→酶解→調(diào)糖→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→酵素產(chǎn)品。

1.3.1 酶解 藍(lán)莓清洗破碎之后經(jīng)Pectinex XXL果膠酶酶解，果膠酶添加量為2.4 mL/kg，于50℃酶解2 h。

1.3.2 調(diào)糖 在室溫條件下，將白砂糖直接加入到藍(lán)莓果汁中，通過手持糖度儀測定糖度，將其糖度調(diào)整至18%。

1.3.3 滅菌 采用巴氏殺菌方式對藍(lán)莓果汁進(jìn)行滅菌，85℃滅菌15 min后冷卻至室溫。

1.3.4 菌種的活化 高活性干酵母用10倍蒸餾水溶解，于35℃恒溫水浴鍋中活化30 min，備用。

1.4 酵母菌發(fā)酵單因素試驗

1.4.1 發(fā)酵時間的確定 調(diào)整藍(lán)莓果汁發(fā)酵初始糖度為18%，酵母菌接種量 0.2%，發(fā)酵初始 pH 4.0，滅菌后置于 25 ℃發(fā)酵，發(fā)酵時間設(shè)定為 1，2，3，4 d，測定蛋白酶活力和SOD酶活力，確定最佳發(fā)酵時間。

1.4.2 發(fā)酵溫度的確定 調(diào)整藍(lán)莓果汁發(fā)酵初始糖度為18%，發(fā)酵初始 pH 4.0，酵母菌接種量 0.2%，滅菌后發(fā)酵液分別在19，22，25，28℃條件下發(fā)酵2 d，測定蛋白酶活力和SOD酶活力，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.4.3 初始pH的確定 調(diào)整藍(lán)莓果汁發(fā)酵初始糖度為18%，酵母菌接種量0.2%，設(shè)置發(fā)酵初始pH分別為3.6、3.8、4.0、4.2，滅菌后在 25 ℃條件下發(fā)酵 2 d，測定蛋白酶和SOD酶活力，確定最佳發(fā)酵初始pH。

1.4.4 接種量的確定 調(diào)整藍(lán)莓果汁發(fā)酵初始糖度為18%，發(fā)酵初始pH 4.0，設(shè)置酵母菌接種量分別為0.10%，0.15%，0.20%，、0.25%，0.30%，滅菌后在 25 ℃條件下發(fā)酵2 d，測定蛋白酶和SOD酶活力，確定酵母菌最佳接種量。

1.4.5 正交試驗 依據(jù)單因素試驗結(jié)果，以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液初始pH和接種量4個因素進(jìn)行L9（34）正交試驗，確定酵母菌發(fā)酵藍(lán)莓果汁的最佳工藝條件。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal test factor level

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 蛋白酶活力 藍(lán)莓酵素蛋白酶活力測定參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》。

1.5.2 SOD酶活力 藍(lán)莓發(fā)酵液離心，取上清液，根據(jù)SOD酶試劑盒說明書進(jìn)行酶活力測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌發(fā)酵單因素試驗

2.1.1 酵母菌發(fā)酵時間對藍(lán)莓酵素酶活力的影響 發(fā)酵時間對藍(lán)莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響如圖1所示。

圖1 發(fā)酵時間對藍(lán)莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響Figure 1 Effect of fermentation time on the activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

由圖1可知：隨著發(fā)酵時間的延長，酶活力逐漸增加，發(fā)酵第2 d蛋白酶活力達(dá)到最高；發(fā)酵第3 d出現(xiàn)蛋白酶活力下降現(xiàn)象，此后趨于穩(wěn)定狀態(tài)。蛋白酶活力下降的原因是，發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機(jī)酸，使發(fā)酵體系的pH降低，從而抑制酶活力。

由圖1還可知：隨著發(fā)酵的進(jìn)行，SOD酶活力不斷增加，發(fā)酵第3 d酶活力達(dá)最大；發(fā)酵第4 d出現(xiàn)酶活力下降現(xiàn)象，可能是發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸抑制了活力。

綜合兩種酶活力的大小，確定酵母菌發(fā)酵藍(lán)莓酵素的最佳發(fā)酵時間為2 d，蛋白酶活力與SOD酶活力分別為 22.92 U /mL 與 28.04 U /g。

2.1.2 酵母菌發(fā)酵溫度對藍(lán)莓酵素酶活力的影響 發(fā)酵溫度對藍(lán)莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對藍(lán)莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響Figure 2 Effect of fermentation temperature on activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

由圖2可知：在19℃時，蛋白酶與SOD酶活力最低，酵母菌發(fā)酵的速率最低；隨著發(fā)酵溫度的上升，蛋白酶與SOD酶活力明顯上升，在25℃時達(dá)到最大值，溫度上升到28℃時，蛋白酶活力稍有下降，而SOD酶活力下降明顯，說明SOD酶活力受溫度的影響較大。綜上所述，酵母菌發(fā)酵最適溫度為25℃。

2.1.3 發(fā)酵液初始pH對藍(lán)莓酵素酶活力的影響 發(fā)酵初始pH對藍(lán)莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵初始pH對藍(lán)莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響Figure 3 Effect of initial pH of fermentation on activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

由圖3可知：pH為3.6時，蛋白酶及SOD酶的活力較低，可能是酶活力受到抑制；發(fā)酵初始pH上升到3.8時，蛋白酶活力及SOD酶活力顯著；提升并達(dá)到最高值；發(fā)酵初始pH大于3.8，功效酶的活力明顯下降，不利于酵母菌發(fā)酵。綜上所述，藍(lán)莓酵素的最佳初始 pH 為 3.8。

2.1.4 酵母菌接種量對藍(lán)莓酵素酶活力的影響 接種量對藍(lán)莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響見圖4。

圖4 接種量對藍(lán)莓酵素蛋白酶活力與SOD酶活力的影響Figure 4 Effect of inoculation amount on activity of blueberry enzyme protease and SOD enzyme

如圖4所示：酵母菌接種量由0.10%增加到0.20%時，蛋白酶活力逐漸增加并達(dá)到最大值；隨著接種量的增加，發(fā)酵液中的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多，不利于發(fā)酵，蛋白酶活力呈下降趨勢；當(dāng)接種量達(dá)0.15%時，SOD 酶活力達(dá)到最高，為 30.23 U/g。 故最佳酵母菌接種量為0.20%。

2.2 酵母菌發(fā)酵藍(lán)莓酵素的工藝條件優(yōu)化

酵母菌發(fā)酵藍(lán)莓酵素正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

由表2極差分析可知：酵母菌發(fā)酵對藍(lán)莓酵素蛋白酶活力影響的主次順序為B＞C＞D＞A，發(fā)酵時間對蛋白酶活力影響最大，其次為發(fā)酵初始pH，發(fā)酵溫度與接種量對蛋白酶活力的影響最小；由K值可知，使蛋白酶活力最大化的最優(yōu)組合為A1B3C1D1，即發(fā)酵溫度 22 ℃，發(fā)酵時間 3 d，初始 pH 3.6，接種量 0.15%；酵母菌發(fā)酵對SOD酶活力影響因素的主次順序為B＞A＞D＞C，發(fā)酵時間對SOD酶活力的影響因素最大，其次為發(fā)酵溫度，接種量與發(fā)酵初始pH對SOD酶活力的影響較??；由K’值可知，使SOD酶活力最大化的最優(yōu)組合為A3B3C2D2，即發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時間3 d，初始 pH 為 3.8，接種量為 0.20%。

表2 酵母菌發(fā)酵藍(lán)莓酵素正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and results of yeast fermentation blueberry enzyme

2.3 最佳工藝條件驗證試驗

最佳工藝條件驗證試驗結(jié)果見表3。

由表3可知：組合A1B3C1D1的蛋白酶活力最高為29.85 U/mL，組合 A3B3C2D2SOD的酶力最高為55.93 U/g；兩種發(fā)酵條件下蛋白酶活力差異不大，而A3B3C2D2的SOD酶活力明顯高于正交最優(yōu)組合A1B3C1D1。因此，藍(lán)莓酵素最佳的發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度 28 ℃，初始 pH3.8，接種量 0.20%，發(fā)酵時間 3 d。在此條件下，藍(lán)莓酵素的蛋白酶活力為29.76 U/mL，SOD 酶活力為 55.93 U/g。

表3 最佳工藝條件驗證試驗Table 3 Verification test for optimaltechnical condition

3 結(jié)論

經(jīng)單因素試驗和經(jīng)正交試驗優(yōu)化后，藍(lán)莓酵素的最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度28℃，初始pH為3.8，接種量為0.20%，發(fā)酵時間為3 d。在此條件下蛋白酶活力達(dá)到 29.76 U/mL，SOD 酶活力達(dá)到 55.93 U/g。 說明通過酵母菌發(fā)酵，可以制備蛋白酶活力與SOD酶活力較高的藍(lán)莓酵素產(chǎn)品。