陳澤宇 徐江紅 郭蓉 邱創(chuàng)鈞 陳兵

急性中耳炎(acute otitis media, AOM)是兒童常見的細(xì)菌感染性疾病之一，尤其是6～18個月的幼兒，而中耳炎及其并發(fā)癥將不同程度地引起兒童聽力障礙，這將可能嚴(yán)重影響幼兒的語言發(fā)育和認(rèn)知能力。在臨床上中耳炎也是使用抗生素治療的主要疾病之一。近年來由于抗生素的大量使用甚至濫用，耐藥菌株明顯增多，抗生素耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。為了減少抗生素的使用，降低中耳炎尤其是兒童中耳炎的發(fā)病率，運(yùn)用疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防愈發(fā)重要。國外已有相關(guān)疫苗用于預(yù)防中耳炎的報道[1]。據(jù)國外文獻(xiàn)[2]報道，肺炎球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌是AOM的前3位主要致病菌。國內(nèi)近期相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查亦顯示肺炎球菌是兒童AOM的主要致病菌之一。研制針對這些主要致病菌的疫苗，將在預(yù)防AOM的發(fā)病方面起到至關(guān)重要的作用。本研究旨在研制能同時針對中耳炎2種主要致病菌又適用于嬰幼兒免疫的結(jié)合疫苗，即以肺炎球菌表面黏附素A(pneumococcal surface adhesin A，PsaA)為蛋白載體，和b型流感嗜血桿菌(hemophilus influenzae b，Hib)多糖結(jié)合的疫苗，達(dá)到預(yù)防2種細(xì)菌感染的作用。本研究在該類疫苗前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過動物實驗驗證其免疫原性和對AOM的免疫預(yù)防效果。

1 材料與方法

1.1 材料 菌種：14型肺炎球菌(中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，產(chǎn)品編號31226)。

主要試劑：Hib多糖(武漢生物制品研究所)，PsaA(鼎泰海規(guī)生物科技有限公司)，辣根過氧化物酶羊抗鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)(ab97240，上海聚仕隆生物科技有限公司)，己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide，ADH)(Sigma公司)，溴化氰(cyanogen bromide，CNBr)(J&K公司)，乙二胺四乙酸(ethylen diamine tetraacetic acid，EDTA)(Sigma公司)。

主要設(shè)備：洗板機(jī)(Biotek 公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司，型號：680)，自動電位滴定儀(瑞士萬通公司)，AKTA層析系統(tǒng)(GE公司)。

實驗動物：約3周齡無特定病原體(specific pathogen free，SPF)雌性SD大鼠30只，體重88～102 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部SPF級實驗室。

1.2 方法

1.2.1 PsaA與Hib多糖的偶聯(lián)結(jié)合 利用酰胺縮合法制備多糖與蛋白的結(jié)合物。將10 mg/mL Hib多糖用CNBr活化，以ADH為連接劑,活化后的Hib-ADH和PsaA以1 ∶1比例進(jìn)行結(jié)合，以碳二亞胺為偶聯(lián)劑，在堿性條件下進(jìn)行反應(yīng)；所得結(jié)合物用Sephrose 4FF層析柱純化，于206 nm和280 nm雙波長處監(jiān)測并收集相應(yīng)洗脫峰處的洗脫液，除菌過濾后即為Hib-PsaA結(jié)合物。

1.2.2 結(jié)合物中蛋白與多糖含量的定量測定 結(jié)合物中PsaA蛋白濃度測定采用改良 Lowry 法，Hib多糖含量測定采用改良鉬酸銨測定法；結(jié)合物中游離多糖含量測定采用脫氧膽酸鈉沉淀法。

1.2.3 PsaA-Hib多糖結(jié)合疫苗免疫原性分析 將幼齡雌性SD大鼠30只運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組分成2組：實驗組15只，接種Hib-PsaA結(jié)合疫苗(疫苗中Hib多糖濃度為31 μg/mL)；對照組15只，作為空白對照，接種磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)。

實驗組免疫接種Hib-PsaA結(jié)合疫苗，于大鼠大腿根前內(nèi)側(cè)皮下注射，每2周接種1次，每次接種0.5 mL(含Hib多糖 15.5μg)，共免疫3次。對照組接種PBS，接種方法同第1組，每次接種0.5 mL，共接種3次。

2組大鼠第3次接種后2周行眼眶采血，以離心機(jī)分離出血清，置于4 ℃下保存待測。

1.2.4 免疫動物血清抗PsaA抗體及抗Hib多糖抗體IgG的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)間接法測定各組大鼠血清抗Hib及抗PsaA抗體IgG滴度。

1)酶標(biāo)板包被抗原及封閉。包被：分別以Hib-牛血清白蛋白溶液及PsaA溶液包被酶標(biāo)板。封閉：將包被板進(jìn)行洗滌，并加入封閉液，再洗滌，拍干待用。

2)樣品ELISA檢測。

(1)樣品稀釋和加樣。將各組血清樣品以1 ∶50稀釋，然后按倍比稀釋法稀釋加樣?？瞻讓φ战M加入稀釋液100 μL，其余各步驟相同。各取100 μL加入抗原包被過的酶標(biāo)板中，置于37 ℃孵育60 min。

(2)洗滌、加酶、顯色。采用洗板機(jī)清洗、拍干，再加入羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，置于37 ℃孵育30 min，清洗、拍干后加入顯色液，37 ℃避光顯色10 min后每孔加終止液。

(3)測定。設(shè)定酶標(biāo)儀波長為450、630 nm，用空白孔調(diào)零點(diǎn)后測定各孔光密度值。

1.2.5 肺炎球菌對免疫后大鼠中耳的攻擊試驗 攻擊試驗于上海市公共衛(wèi)生臨床中心動物實驗部生物安全二級實驗室(ABSL-2)中進(jìn)行。

1)大鼠中耳內(nèi)注射肺炎球菌。選擇免疫接種的幼齡大鼠，于末次免疫后2周進(jìn)行中耳細(xì)菌攻擊試驗。具體方法如下：大鼠以氯胺酮(60 mg/kg)+甲苯噻嗪(6 mg/kg)腹腔注射麻醉，以75%乙醇消毒耳部，在手術(shù)顯微鏡下分別于雙耳以微量注射器經(jīng)鼓膜穿刺向中耳內(nèi)注入14型肺炎球菌懸液，濃度5.3×109CFU/mL (CFU為菌落形成單位)，每耳注入20 μL。

2)大鼠中耳標(biāo)本組織病理學(xué)分析比較。首批于細(xì)菌攻擊后3 d，實驗組和對照組大鼠各取5只，斷頭，取出聽泡，以4%多聚甲醛固定，再置于10%乙二胺四乙酸脫鈣2周。制作石蠟包埋切片，作蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色。顯微鏡下作組織病理學(xué)觀察分析。

第2批于細(xì)菌攻擊后7 d，實驗組和對照組大鼠再各取6只，斷頭，取出聽泡。其余操作同首批標(biāo)本。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 以統(tǒng)計軟件SPSS 11.5對2組大鼠血清的抗體滴度行對數(shù)轉(zhuǎn)換后作均數(shù)的單因素方差分析檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PsaA蛋白與Hib多糖偶聯(lián)結(jié)合 運(yùn)用酰胺縮合法成功將PsaA蛋白與Hib多糖偶聯(lián)結(jié)合。結(jié)果顯示，PsaA蛋白經(jīng)Sephrose 4FF層析柱的層析收集峰值在130 mL左右(圖1)，結(jié)合物的層析收集峰值在58 mL左右(圖2)。因結(jié)合物分子量增大，使峰值明顯前移，提示結(jié)合成功。

圖1. PsaA經(jīng)Sephrose 4FF層析柱層析的結(jié)果

圖2. PsaA與Hib多糖結(jié)合物經(jīng)Sephrose 4FF層析柱層析結(jié)果(紅色曲線) 58.06 mL處的收集峰為結(jié)合物峰

2.2 結(jié)合物蛋白與多糖的定量測定及結(jié)合物回收率 PsaA-Hib結(jié)合物中多糖含量為31 μg/mL，蛋白含量為42 μg/mL，多糖/蛋白含量比為0.74。

2.3 結(jié)合疫苗免疫幼齡大鼠后血清相關(guān)抗體檢測 免疫后各組大鼠血清抗PsaA抗體滴度及抗Hib抗體滴度檢測結(jié)果見表1。抗體滴度讀數(shù)的確定以ELISA中PBS作陰性參照。

表1 免疫后各組大鼠血清抗PsaA抗體及抗Hib抗體滴度及幾何平均滴度(GMT)

先對抗體滴度作對數(shù)轉(zhuǎn)換，然后運(yùn)用兩樣本均數(shù)差別的方差分析法作統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示：抗PsaA IgG滴度在實驗組與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=147.93，P<0.001)；抗Hib IgG滴度在2組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=279.30，P<0.001)。

2.4 攻擊試驗 實驗組和對照組大鼠在肺炎球菌中耳攻擊后第3天和第7天中耳組織炎癥反應(yīng)情況的病理組織學(xué)檢查結(jié)果見圖3～4。

1)細(xì)菌攻擊后3 d，實驗組大鼠中耳炎癥反應(yīng)輕微；對照組大鼠中耳炎癥反應(yīng)較重，可見組織細(xì)胞水腫、間質(zhì)充血、炎細(xì)胞浸潤明顯(圖3)。

2)細(xì)菌攻擊后7 d，實驗組大鼠中耳炎癥反應(yīng)較輕，見輕度充血，水腫不明顯；對照組大鼠中耳炎癥反應(yīng)重，可見組織細(xì)胞腫脹變性、炎細(xì)胞浸潤進(jìn)一步加重(圖4)。

圖3. 實驗組(A)和對照組(B)大鼠經(jīng)細(xì)菌攻擊3 d的中耳組織 (HE染色×50)

圖4. 實驗組(A)和對照組(B)大鼠經(jīng)細(xì)菌攻擊7 d的中耳組織(HE 染色 ×50)

3 討論

由于兒童咽鼓管解剖結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)及免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善、抵抗力弱等因素，AOM在兒童尤其是3歲以下幼兒中發(fā)病率甚高，且易反復(fù)發(fā)作，給兒童帶來聽力障礙及由此產(chǎn)生的語言及認(rèn)知發(fā)育等影響。曾有學(xué)者報道，70%～90%的兒童6歲前至少有1次中耳炎發(fā)作[3]，在3歲以下兒童中患過AOM者高達(dá)75%[4]。在臨床上中耳炎也是使用抗生素治療的主要疾病之一。近年來由于抗生素的大量使用甚至濫用，耐藥菌株明顯增多，臨床常用抗生素的高耐藥率已不容忽視[5]。為了減少抗生素的使用，降低中耳炎尤其是兒童中耳炎的發(fā)病率，使用疫苗預(yù)防和治療AOM是極好的方法和重要的手段[6]。國外幾年前已有疫苗預(yù)防中耳炎的臨床應(yīng)用報道，而國內(nèi)尚罕見預(yù)防中耳炎的疫苗用于臨床的研究報告。

肺炎球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌是AOM致病菌的前3位主要病菌，據(jù)國外文獻(xiàn)[7]報道，這3種病菌分別占40%～50%、20%～30%和10%～15%。國內(nèi)近年的相關(guān)研究顯示，金黃色葡萄球菌和肺炎球菌是AOM的最主要致病菌[5]。因此，研制并應(yīng)用針對這幾種致病菌的疫苗，將可在預(yù)防AOM的發(fā)病方面起到至關(guān)重要的作用。目前國外已經(jīng)用于臨床針對AOM的疫苗主要有多價肺炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖與其他細(xì)菌蛋白結(jié)合疫苗[8-9]。但有如下不足：①多糖疫苗只能引起非胸腺依賴性免疫應(yīng)答，對于免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟，僅可誘發(fā)胸腺依賴型免疫反應(yīng)的嬰幼兒來說作用甚微；②疫苗的抗原成分肺炎球菌多糖具有型特異性，僅對疫苗所包含的肺炎球菌多糖亞型有效。由于肺炎球菌的莢膜多糖具有90多個血清型，以肺炎球菌莢膜多糖為抗原制備的疫苗接種所產(chǎn)生的抗體具有型特異性特點(diǎn)，只對所包含多糖血清型的肺炎球菌具備免疫保護(hù)作用[8]。但不同的國家和地區(qū)其主要的致病血清型是不盡相同的，同一個地區(qū)隨著時間的變化其致病血清型也會發(fā)生變化[10-11]。Fletcher等[12]總結(jié)了5個關(guān)于肺炎球菌多糖與白喉毒素蛋白或腦膜炎奈瑟菌蛋白結(jié)合疫苗的臨床試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疫苗對減少AOM的發(fā)作，尤其是AOM的復(fù)發(fā)是有效的，但主要是對疫苗所包含的肺炎球菌血清型所致的AOM有效，有效率約60%，而對所有AOM的有效率則為0～34%，可見肺炎球菌多糖作抗原的結(jié)合疫苗的局限性。PsaA、肺炎球菌表面蛋白、肺炎球菌溶血素作為肺炎球菌的主要抗原蛋白，具有免疫原性，它們的特點(diǎn)是在各種多糖血清型的肺炎球菌之間具有交叉免疫保護(hù)作用[13]。PsaA為肺炎球菌表面結(jié)合脂蛋白，在肺炎球菌黏附呼吸道黏膜過程中起關(guān)鍵作用。PsaA是各型肺炎球菌共有的一種遺傳保守的、種特異性的表面蛋白抗原，具有較好的免疫原性。有學(xué)者[14-15]報道，PsaA是降低肺炎球菌在機(jī)體呼吸道上皮寄生主要的抗原蛋白。由于各種血清型的肺炎球菌PsaA是相同的，本研究以肺炎球菌抗原蛋白PsaA作為結(jié)合疫苗的成分之一，將有可能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生對各種血清型肺炎球菌感染均有預(yù)防作用的抗體，且其另一抗原成分為Hib多糖，因此結(jié)合了AOM 2種主要致病菌的抗原，有望在預(yù)防AOM的發(fā)病方面發(fā)揮優(yōu)勢。同時，作為多糖蛋白結(jié)合疫苗，其對幼齡個體AOM的好發(fā)人群即2歲以下嬰幼兒同樣有效。隨著肺炎球菌疫苗應(yīng)用的逐漸推廣，流感嗜血桿菌導(dǎo)致的AOM比例有增高趨勢[16]；因此，疫苗中包含針對流感嗜血桿菌的抗原成分顯得日益重要。

作者在前期的研究中已應(yīng)用基因工程技術(shù)成功制備PsaA，并且也已摸索出細(xì)菌莢膜多糖和蛋白結(jié)合制備結(jié)合疫苗的技術(shù)[17-18]，為本項目流感嗜血桿菌多糖與PsaA的結(jié)合疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。前期研究已成功地將Hib多糖與PsaA蛋白交聯(lián)結(jié)合，并在幼齡小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)[18]。本研究進(jìn)一步優(yōu)化和完善了Hib-PsaA結(jié)合疫苗制備的實驗方法和條件，并在幼齡大鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生了有效的免疫應(yīng)答，通過肺炎球菌的中耳攻擊試驗顯示出其對AOM有效的免疫保護(hù)作用，再次證明所研制的新型疫苗對幼齡個體有較好的免疫原性。

本研究中細(xì)菌攻擊試驗結(jié)果顯示，在攻擊后第3天，實驗組大鼠的中耳炎癥反應(yīng)程度輕于對照組，這種差異在攻擊后第7天更趨明顯。此現(xiàn)象表明，接種本研究研制的疫苗，能使幼齡大鼠有效抵御肺炎球菌感染后產(chǎn)生的中耳炎癥反應(yīng)。

我們期望在取得此新型結(jié)合疫苗實驗研究的成功之后能進(jìn)一步走向臨床應(yīng)用試驗階段，并最終用于嬰幼兒和其他易感人群，以大幅降低AOM的發(fā)病率，以期取得顯著的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。