易志健 江 敏 崔浩東 王 菲 周文華 黃逸凡 喻學鋒

(中國科學院深圳先進技術研究院 生物醫(yī)藥與技術研究所 深圳 518055)

1 引 言

低溫等離子體(Cold Atmospheric Plasma，CAP)，作為一種由電子和離子群組成的近電中性電離氣體，因其溫度接近室溫，且在大氣壓下即可產生，也被稱作大氣壓低溫等離子體，其組分主要包括活性粒子、紫外輻射、帶電粒子及瞬時電場。其中，活性粒子主要有活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)和活性氮(Reactive Nitrogen Species，RNS)兩大類?；钚匝踔饕?O2－、H2O2、·OH、1O2等；活性氮主要包括·NO、·NO2、NO3－、ONOO－等[1,2]。研究表明，等離子體技術在生物醫(yī)學領域表現出其特有的價值，廣泛應用于血液凝固、傷口愈合、消毒滅菌、牙齒美白及腫瘤治療等方面[3,4]。其中在腫瘤治療方面的應用引起了國內外學者的廣泛關注[5]?；熥鳛楫斍爸委熌[瘤的主要方式，在多次給藥后，腫瘤細胞對化療藥物表現出明顯的耐藥性，極大地影響了治療效果。為此，逆轉腫瘤細胞的耐藥性，尋找新型癌癥治療手段具有重大意義[6,7]。研究顯示，在低溫等離子體與細胞作用過程中，培養(yǎng)基內的 ROS 等物質濃度顯著增加，從而誘發(fā)細胞凋亡[8,9]，而且產生的 ROS可以影響細胞膜通透性，有利于細胞內吞的發(fā)生[10]。此外，低溫等離子體可以選擇性殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞影響較小[11]。

阿霉素(Doxorubicin，DOX)作為一種廣譜的化療藥物，但其本身對細胞沒有選擇性，容易導致腫瘤細胞產生耐藥性，進而影響藥效發(fā)揮[12]。而金納米棒(Gold Nanorods，Au NRs)被細胞攝取以后，對溶酶體膜產生作用，致使溶酶體破裂，進而引發(fā)細胞壞死和凋亡[13]。相對于DOX，Au NRs 通過受體介導的內吞作用被內含體包裹后進入細胞，逃避 P-糖蛋白識別，可對耐藥細胞產生殺傷[14]，但也受到藥物濃度和作用時間的限制。

本文提出一種雙介質阻擋放電低溫等離子體射流裝置(以下統(tǒng)稱“CAP”)來殺傷腫瘤細胞。同時，針對腫瘤細胞對 DOX 及 Au NRs 的耐藥性，對 MCF-7 乳腺癌細胞進行化療增敏，并探討了化療增敏的作用機理。

2 實驗方法

2.1 實驗裝置的搭建

圖1 低溫等離子體聯合化療藥物殺傷腫瘤細胞示意圖Fig. 1 Scheme of cold atmospheric plasma combined chemotherapeutic drugs for cancer cell killing

實驗裝置如圖1所示，低溫等離子體負載采用雙介質阻擋放電裝置。其中，高壓電極為直徑2 mm 的銅棒，內介質為內徑 2 mm、外徑 4 mm的 U 型石英管，外介質為 5 mL 的石英針筒。接地電極采用細銅絲，纏繞在針筒的噴嘴處，與高壓電極之間距離為 10 mm。整個實驗裝置作用氣體選用高純氬氣，電源采用蘇曼 CTP-2000K 的高壓交流電源。

實驗過程中，利用高壓探頭 Tektronix P6015A、電流探頭 Pearson 6585 和示波器Tektronix TBS1102 測得放電電壓峰值為 18 kV，電流峰值為 128.8 mA。利用 Fluke TiS75 紅外熱像儀，測得低溫等離子體射流溫度為 26.7℃。

2.2 低溫等離子體作用后培養(yǎng)基內活性氧水平檢測

(1)ROS 探針配制：獲得 2', 7'-二氯熒光素二乙酸鹽(DCFDA)，溶于二甲基亞砜(DMSO)中，得到 10 mmol/L 的儲備液，于－20℃ 避光保存。

(2)細胞培養(yǎng)：MCF-7 乳腺癌細胞于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，培養(yǎng)基為包含 10% 牛血清白蛋白(FBS)的改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)。

(3)MCF-7 細胞以每孔 5×104個的密度種植于 24 孔板內，過夜培養(yǎng)以后，換為 500 μL 新鮮DMEM 培養(yǎng)基。其中，在空白 24 孔板中加入等量 DMEM 培養(yǎng)基，作培養(yǎng)基組。

(4)搭建低溫等離子體設備，調節(jié)參數，調整等離子體與培養(yǎng)基液面的距離，進行等離子體處理。

(5)選擇適當的培養(yǎng)時間，取 100 μL 培養(yǎng)基，加入 10 μmol/L DCFDA 熒光探針，于 37℃孵育 30 min，然后通過熒光光譜儀(HITACHI F-4600)檢測熒光變化，激發(fā)波長為 485 nm。

2.3 低溫等離子體作用后細胞內活性氧及鈣離子水平檢測

(1)ROS 探針配制：獲得 2', 7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)，溶于 DMSO 中，得到10 mmol/L 的儲備液，于－20℃ 避光保存。

(2)Ca2＋檢測探針配制：獲得 Fluo 3-AM，溶于 DMSO 中，得到 2 mmol/L 的儲備液，于－20℃ 避光保存。

(3)MCF-7 以每孔 5×104個的細胞密度種植于 24 孔板內，過夜培養(yǎng)以后，換為 500 μL 新鮮DMEM 培養(yǎng)基。

(4)調節(jié)等離子體參數，調整同培養(yǎng)基液面間的高度，進行等離子體處理。

單獨紫外(UV)處理：在等離子體和孔板間加裝接地鐵絲網，用石英片蓋住孔板，再進行處理。

單獨電場處理：用防紫外玻璃片蓋住孔板，再用等離子體處理。

(5)細胞于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后通過熒光倒置顯微鏡(Olympus IX71)進行 ROS 及 Ca2＋檢測。

(6)細胞內 ROS 檢測：采用磷酸鹽緩沖液(PBS)對(5)中細胞進行清洗后，加入分散于 PBS的 10 μmol/L DCFH-DA 熒光探針。繼續(xù)孵育 30 min后，進行 PBS 清洗，于 490 nm 藍光激發(fā)下進行熒光成像檢測。

(7)細胞內 Ca2＋檢測：采用 PBS 對(5)中細胞進行清洗后，加入分散于杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)的 2 μmol/L Fluo 3-AM 熒光探針。繼續(xù)孵育 20 min 后，加入含有 1% FBS 的 DPBS 繼續(xù)孵育 40 min。DPBS 清洗后，于 490 nm 藍光激發(fā)下進行熒光成像檢測。

2.4 金納米棒的制備

金納米棒(Au NRs)采用種子生長法進行制備[15]，合成路徑如下。

(1)制備種子液：將 5 mL 5 mmol/L 氯金酸(HAuCl4)溶液和 5 mL 0.2 mol/L 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液互溶后，加入 4.5 mL 的超純水，混勻。再加入用冰水現配的 600 μL 10 mmol/L硼氫化鈉(NaBH4)溶液，充分攪拌 2 min，獲得種子液，于室溫下備用。

(2)制備生長液：先后加入 0.2 mol/L CTAB溶液 6 mL、5 mmol/L HAuCl4溶液 1.2 mL、0.1 mol/L 硝酸銀(AgNO3)溶液 15 μL 和 1.2 mol/L鹽酸(HCl)溶液 12 μL，再加入 10 mmol/L 抗壞血酸溶液 700 μL，輕旋使溶液由暗紅色變?yōu)闊o色。

(3)在生長液中迅速注入 12 μL 種子液，37℃過夜反應，然后使用 12 000 rpm 離心 10 min，得到的沉淀用等體積的超純水再分散，獲得 Au NRs。經過透射電鏡(JEM-3200FS)觀察，Au NRs 長軸50～60 nm，短軸 10～20 nm。

2.5 低溫等離子體聯合化療藥物協同殺傷腫瘤細胞

(1)MCF-7 以每孔 5×104個的細胞密度種植于 24 孔板內，過夜培養(yǎng)以后，換為 500 μL 新鮮DMEM 培養(yǎng)基。DOX 及 Au NRs 按照不同濃度分散于培養(yǎng)基內。

(2)調節(jié)等離子體參數，穩(wěn)定氣流，調整升降臺，使等離子體至培養(yǎng)基液面距離為 25 mm，進行等離子體處理。

(3)處理完成后，關閉等離子體設備，細胞于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)至 24 h。

(4)CCK-8 細胞存活率檢測：移除培養(yǎng)基，加入 300 μL 的 CCK-8 工作液。繼續(xù)孵育 1 h后，吸取 150 μL 培養(yǎng)液至 96 孔板，用酶標儀測試 450 nm 處吸收值。其中，對照組為同樣濃度未進行等離子體處理的化療藥物組。

(5)鈣黃綠素-AM/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)染色實驗：移除培養(yǎng)基，加入 300 μL 分散于 PBS的 Calcein-AM/PI 工作液(2 μg/mL Calcein-AM，3 μg/mL PI)，繼續(xù)孵育 10 min，PBS 清洗后進行熒光成像。其中，Calcein-AM 使活細胞在藍光(490 nm)激發(fā)下呈綠色熒光(515 nm)，PI 使死細胞在綠光(535 nm)激發(fā)下呈紅色熒光(617 nm)。

3 結果與討論

3.1 低溫等離子體處理后培養(yǎng)基內活性氧檢測

低溫等離子體作用細胞培養(yǎng)基，可以增加培養(yǎng)基內活性粒子的含量，主要是 ROS 的濃度有所增加。為此，通過調節(jié)等離子體參數，設定一定的電壓，處理種植于 24 孔板的 MCF-7 細胞培養(yǎng)基，等離子體距離液面間距設定為 25 mm。處理完成后，取 100 μL 培養(yǎng)基用于 ROS 檢測。ROS 可以將非熒光的 DCFDA 探針氧化為具有熒光信號的氧化型二氯熒光素(DCF)，進而可通過熒光增加的幅度來評估培養(yǎng)基內 ROS的水平。等離子體處理 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基，不同處理時間的結果如圖2(a)所示。由圖2(a)可以發(fā)現，經等離子體處理后，培養(yǎng)基內的 ROS 濃度增加。同時，處理 10～80 s 后發(fā)現，隨著處理時間的延長，ROS 濃度明顯增加。此外，細胞存在的情況下，相同處理時間，培養(yǎng)基內 ROS 濃度有一定的降幅，認為細胞消耗了一定量的 ROS 用于磷脂和膜蛋白的氧化。同時用等離子體處理磷酸鹽緩沖液(PBS)發(fā)現，熒光信號很弱，且沒有隨處理時間的延長而增加。推測等離子體作用培養(yǎng)基后產生的ROS，多數來自于等離子體與培養(yǎng)基內組分的相互作用。因而針對培養(yǎng)基內不同的組分，檢測等離子體作用前后 ROS 的變化。

首先，檢測培養(yǎng)基內 FBS 對 ROS 的影響，結果如圖2(b)所示。由圖2(b)可以看到，FBS濃度在 0～10% 時，ROS 的水平隨著 FBS 濃度的增加而增強。但當 FBS 濃度增加至 15% 時，ROS 水平含量有所下降，且無論細胞存在與否，結果均顯示出一定的降幅，表明 ROS 水平受到培養(yǎng)基內 FBS 的直接影響，該結論與不同 FBS濃度下 U87 細胞存活率一致[16]。其次，檢測了培養(yǎng)基內葡萄糖濃度對等離子體處理后 ROS 的影響，結果如圖2(c)所示。當無 FBS 存在時，隨著葡萄糖濃度的增加，ROS 水平沒有顯著變化；而培養(yǎng)基內存在 10% FBS 時，隨著葡萄糖濃度的增加，ROS 水平顯著升高，進一步揭示了 FBS 對等離子體處理后培養(yǎng)基內 ROS 的影響。最后，檢測了培養(yǎng)基內其他組分對 ROS 的影響，結果如圖2(d)所示。在培養(yǎng)基內加入谷胱甘肽、丙酮酸鈉及L-半胱氨酸后，培養(yǎng)基內 ROS 的濃度明顯降低，且 FBS 存在與否沒有直接影響，表明這些物質起到了抑制 ROS 的作用。綜上所述，FBS 和葡萄糖對等離子體處理后培養(yǎng)基內 ROS 的水平存在顯著的影響。因此，在進行等離子體殺傷腫瘤細胞實驗時，培養(yǎng)基選擇包含 10% FBS 的高糖 DMEM。

圖2 低溫等離子體作用后培養(yǎng)基內活性氧水平檢測Fig. 2 Detection of reactive oxygen species levels in medium after cold atmospheric plasma treatment

3.2 細胞內活性氧及鈣離子水平檢測

由于培養(yǎng)基內 ROS 水平的變化會進一步影響細胞的存活狀態(tài)，因此探究了殺傷細胞的機制。將 MCF-7 細胞種植于 24 孔板，過夜培養(yǎng)后，更換為 500 μL 新鮮 10% DMEM 培養(yǎng)基，等離子體處理時間設定為 40 s。處理完成后，細胞于 37℃ 培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育 2 h，然后進行細胞內ROS 及 Ca2＋水平檢測。其中，細胞內 ROS 檢測選擇 DCFH-DA 探針，該探針本身沒有熒光，被細胞攝取后，細胞內的酯酶將其水解為不能透過細胞膜的還原型二氯熒光素(DCFH)，接著細胞內的 ROS 將其氧化為具有綠色熒光信號的DCF，通過細胞內熒光信號的強弱從而評估細胞內 ROS 水平。細胞內 Ca2＋水平通過熒光探針Fluo 3-AM 進行檢測：細胞攝取 Fluo 3-AM 后，酯酶將其水解為 Fluo 3 而滯留在細胞內，Fluo 3與細胞內 Ca2＋結合后，表現出顯著的綠色熒光。細胞內 ROS 及 Ca2＋水平檢測結果如圖3所示，等離子體處理細胞后，細胞質顯示出綠色熒光信號，表明細胞內存在 ROS 和 Ca2＋。而處理前加入 ROS 抑制劑 N-乙酰半胱氨酸(NAC)后，熒光信號顯著降低減弱，表明細胞內的 ROS、Ca2＋主要來自于培養(yǎng)基。此外，單獨電場及 UV作用細胞后，細胞內的熒光信號并沒有增加，表明培養(yǎng)基內的 ROS 可能來自于等離子體產生的活性粒子與培養(yǎng)基內組分的相互作用。培養(yǎng)基內的 ROS 作用于細胞膜，改變了細胞膜的通透性，進而將細胞外的 ROS、Ca2＋及其他物質轉運至細胞內，而細胞內 ROS、Ca2＋水平的增加進一步誘導細胞凋亡的發(fā)生。

3.3 低溫等離子體聯合化療藥物殺傷腫瘤細胞

圖3 低溫等離子體作用后細胞內活性氧及 Ca2＋ 水平檢測(比例尺均為 50 μm)Fig. 3 Detection of intracellular reactive oxygen species and Ca2+ levels after cold atmospheric plasma treatment

低溫等離子體作用培養(yǎng)基產生大量的 ROS，使得細胞膜通透性發(fā)生改變，將外源 ROS 和Ca2＋轉運至細胞內，誘發(fā)細胞凋亡。與此同時，細胞膜通透性的改變，一定程度上增加了細胞對外源物質的攝取，因而可以將一些化療藥物或具有化療效果的納米材料更多地轉運至細胞內，從而顯示出增敏耐藥性細胞化療的效果。本文選擇 DOX 和 Au NRs 聯合等離子體來殺傷腫瘤細胞。首先，將化療藥物按照不同濃度加入到細胞培養(yǎng)基中，等離子體處理 40 s后，MCF-7 細胞繼續(xù)孵育至 24 h；然后，通過CCK-8 法檢測細胞存活率，同時通過 Calcein-AM/PI 進行細胞活死染色。等離子體聯合 DOX殺傷細胞的 CCK-8 結果如圖4(a)所示。由圖4(a)可以看到，等離子體單獨作用細胞，顯示出 20% 的細胞殺傷效率。MCF-7 細胞對 DOX表現出濃度依賴的細胞毒性：當 DOX 濃度為4 μg/mL 時，顯示出 46% 的細胞殺傷效率；而聯合等離子體治療后，細胞殺傷效率增加至 88%。表明除了等離子體帶來的細胞毒性外，通過改善細胞膜通透性，增加細胞對 DOX 的攝取，進而增敏了 DOX 的化療效果。等離子體聯合 Au NRs 殺傷腫瘤的 CCK-8 結果如圖4(b)所示。聯合治療的細胞殺傷率為 90%，而 16 μg/mL Au NRs 帶來的細胞殺傷效率僅為 64%，也顯示出等離子體增敏化療的效果。相對于等離子體聯合 Au NRs 的治療效果，聯合 DOX 表現出更好的增敏效果。表明細胞膜通透性的增加對于小分子藥物的轉運好于稍大尺寸的 Au NRs(長軸：(55.8±3.54)nm；短軸：(12.4±1.43)nm)。接下來，分別選擇2 μg/mL DOX、16 μg/mL Au NRs 聯合等離子體治療癌細胞。在相應濃度下，2 種藥物單獨殺傷效率都在 50% 以上。分別取藥物單獨處理或藥物聯合等離子體處理后 24 h 的細胞進行 Calcein-AM/PI 活死細胞染色實驗，其中綠色熒光信號表示活細胞，而紅色熒光表示死細胞，染色結果如圖4(c)所示。相對于單獨藥物組，等離子體聯合治療后，紅色熒光信號顯著增加，進一步證實了等離子體對 MCF-7 乳腺癌細胞顯示出化療增敏的效應。

圖4 低溫等離子體聯合化療藥物殺傷腫瘤細胞Fig. 4 Cold atmospheric plasma combined chemotherapeutic drugs for cancer cell killing

4 與國內外相似研究對比分析

Graves 與 Bauer[17]認為低溫等離子體產生的活性氧/氮物質引發(fā)了凋亡介導的信號通路。Yan等[16]使用低溫等離子體裝置處理含不同 FBS 濃度(0、10%、20%、30%)的培養(yǎng)基發(fā)現，隨著培養(yǎng)基中 FBS 濃度的增加，U87 細胞存活率增加。本文中 15% FBS 的培養(yǎng)基經過等離子體處理后，培養(yǎng)基內 ROS 水平有所降低，細胞存活率上升，與 Yan 等[16]實驗結果一致。但是 0～10% FBS 的培養(yǎng)基經處理后，ROS 水平上升，對應的細胞存活率降低，填補了 FBS 濃度小于 10% 時等離子處理對細胞影響的空白。

Torii 等[18]發(fā)現低溫等離子體能有效誘導胃癌細胞凋亡，且對正常成纖維細胞(WI-38)沒有顯著的凋亡發(fā)生。Mirpour 等[19]發(fā)現等離子體能顯著降低乳腺癌細胞活力，對正常細胞影響不大。Jalili 等[20]使用低溫等離子體聯合鐵納米顆粒降低MCF-7 細胞存活率。Cheng 等[21]使用等離子體處理 U87 人膠質瘤細胞后，細胞攝取金納米顆粒的效率顯著增加，而正常人星形膠質細胞(E6/E7)對金納米顆粒的攝取速率沒有顯著增加，其表現出的細胞選擇性，使低溫等離子體可以聯合金納米顆粒對腫瘤細胞進行殺傷。Zhu 等[22]認為等離子體聯合載藥核殼納米顆粒殺傷腫瘤，主要通過下調癌細胞增值和轉移相關基因的表達，以及增加細胞對載藥核殼納米顆粒的攝取，來有效改善化療中細胞的耐藥性。本文通過等離子體聯合 DOX及 Au NRs 殺傷腫瘤細胞，通過改善細胞膜通透性，增加了腫瘤細胞對藥物的攝取速率，進一步增敏了 DOX 和 Au NRs 的化療效果。

5 結論與展望

低溫等離子體作用細胞以后，培養(yǎng)基內 ROS水平隨著處理時間的增加而顯著上升，且細胞的存在一定程度上消耗了培養(yǎng)基內的 ROS。在 0～10% FBS 范圍內，培養(yǎng)基內 ROS 水平隨著 FBS 濃度的增加而升高；而 FBS 濃度增加至15% 時，ROS 水平開始下降，且細胞存活率同FBS 濃度呈負相關。同時葡萄糖濃度的改變也對培養(yǎng)基內 ROS 的增加有所貢獻。培養(yǎng)基內存在谷胱甘肽、丙酮酸鈉和L-半胱氨酸時，ROS 會顯著降低，揭示其起到抑制 ROS 的作用。培養(yǎng)基內 ROS 的增加進一步改善了細胞膜通透性，使得外源 ROS 和 Ca2＋水平顯著增加，而單獨電場及 UV 作用并沒有增加細胞內的 ROS 和 Ca2＋。與此同時，處理前添加 ROS 抑制劑 NAC 后，細胞內 ROS、Ca2＋濃度也顯著降低。表明等離子體作用培養(yǎng)基產生的 ROS，通過影響細胞膜通透性來提高細胞內 ROS 和 Ca2＋水平，進一步誘導細胞凋亡。等離子體單獨作用細胞，可以殺傷 20%的 MCF-7 乳腺癌細胞。分別聯合 DOX、Au NRs治療后，細胞殺傷效率增加為 88% 和 90%，而單獨藥物治療的殺傷效率只有 46% 和 64%，揭示了等離子體對 MCF-7 乳腺癌細胞的化療增敏效果。

低溫等離子體作用細胞產生 ROS 的機理還不夠明確，細胞膜通透性改變的機制還需要進一步研究。但等離子體能選擇性致死腫瘤細胞、改善細胞膜通透性及增敏化療效果，可為抗腫瘤提供一種新的思路。等離子體技術與抗癌藥物或納米材料有機結合，能夠極大地提高癌細胞的滅活效果，在癌癥治療領域尤其是皮下治療具有廣闊的應用前景。