江 敏 王 菲 易志健 喻學(xué)鋒 黃逸凡 周文華 朱劍豪

1(深圳市中科摩方科技有限公司 深圳 518114)2(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 生物醫(yī)藥與技術(shù)研究所 深圳 518055)

1 引 言

核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)廣泛存在于各種環(huán)境中，在人和動物的唾液、汗液和血液中均可常見。它是由數(shù)個(gè)半胱胺酸基組成一類結(jié)構(gòu)緊湊、體積較小的蛋白質(zhì)。其中，半胱胺酸基之間采用二硫鍵連接形成[1]，這種結(jié)構(gòu)方式使得變性的核糖核酸酶容易在室溫下恢復(fù)原有的結(jié)構(gòu)，難以被滅活。同時(shí)，核糖核酸酶具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，容易使核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)分解，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾，尤其是 RNA 提取實(shí)驗(yàn)。如何有效去除核糖核酸酶污染已成為實(shí)驗(yàn)室污染亟待解決的一個(gè)難題。目前，去除核糖核酸酶的常用方法有：焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡[1]、高溫高壓滅菌和RNase 抑制劑。然而，焦碳酸二乙酯是高活性烷化試劑，對人體有害且存在致癌風(fēng)險(xiǎn)；高溫高壓滅菌和 RNase 抑制劑不能使核糖核酸酶完全滅活。

低溫等離子體因其含有大量高能電子、自由基和激發(fā)態(tài)原子等活性粒子，備受關(guān)注與研究。大量研究表明低溫等離子體能夠有效破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。Segat 等[2]利用低溫等離子體對乳清分離蛋白溶液進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)作用 15 min 后，蛋白質(zhì)全部發(fā)生了氧化。Kim[3]研究了氦氣/氧氣低溫等離子體處理生物分子效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)活性氧自由基對細(xì)胞內(nèi)多肽、DNA 和酶蛋白具有損傷作用。Deng 等[4]利用激光誘導(dǎo)技術(shù)從放電電壓、氧氣流量等方面研究氦氣/氧氣等離子體滅活蛋白的機(jī)制。Jijie 等[5]以牛血清蛋白為模型研究了氦等離子體射流對蛋白結(jié)構(gòu)的影響。Takai 等[6]以溶菌霉為蛋白模型研究了等離子體對蛋白功能的影響。Topala 和 Nagatsu[7]用氦等離子體射流處理牛血清蛋白和游離蛋氨酸發(fā)現(xiàn)它們極易被等離子體氧化。Lackmann 等[8]用蛋白和 DNA 模型來研究污水中等離子體滅菌的機(jī)理。陳緒松等[9]利用蛋白含量測定和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術(shù)分析了經(jīng)等離子體射流處理過的牛血清蛋白，結(jié)果推測等離子體產(chǎn)生的活性成份可使牛血清蛋白變性或斷裂成片段。Lackmann 等[10]以牛血清蛋白為模型研究，從拉曼光譜測得的等離子體射流能夠氧化酪氨酸殘基和含硫氨基酸，但半膀氨酸沒有明顯的氧化現(xiàn)象。Lackmann等[11]利用雙介質(zhì)阻擋放電(Dielectric Barrier Discharge，DBD)裝置產(chǎn)生的氦氣/氧氣等離子體射流對 RNase 進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其對RNase 具有顯著的滅活效果。然而，等離子體滅活效果受到作用氣體類型和發(fā)生器結(jié)構(gòu)等因素的影響，目前尚不清楚其他作用氣體類型對RNase 的滅活效果，且 DBD 射流因結(jié)構(gòu)的限制，在實(shí)際應(yīng)用中難以實(shí)現(xiàn)大面積、高效的滅活效果。

針對上述存在的問題，本文主要探討低溫等離子體技術(shù)在核糖核酸酶滅活的應(yīng)用，并分析了等離子體活性粒子密度的兩個(gè)關(guān)鍵影響因素(作用氣體類型和等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu))對核糖核酸酶滅活效果的影響。旨在確定等離子體滅活核糖核酸酶最佳作用氣體類型和發(fā)生器結(jié)構(gòu)，為等離子體技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室污染處理領(lǐng)域應(yīng)用推廣提供參考依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本文主要采用了雙介質(zhì)阻擋放電裝置、懸浮電極式介質(zhì)阻擋放電(Floating-Electrode Dielectric Barrier Discharge，F(xiàn)E-DBD)裝置和表面介質(zhì)阻擋放電(Surface Dielectric Barrier Discharge，SDBD)裝置對核糖核酸酶進(jìn)行滅活研究：前者用于探討不同作用氣體對核糖核酸酶活性的影響；后兩者(可大面積處理的等離子體發(fā)生器)用于探討等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)對核糖核酸酶活性的影響。文中所涉及的放電裝置如圖1所示。其中，雙介質(zhì)阻擋放電裝置的高壓電極為直徑 2 mm 的銅棒，內(nèi)介質(zhì)為內(nèi)徑 2 mm、外徑 4 mm 的石英管，外介質(zhì)為 2 mL 的石英針筒。懸浮電極式介質(zhì)阻擋放電裝置則采用直徑為 30 mm、厚度為 0.5 mm 的圓形銅板作為高壓電極，并將其置于外徑為 35 mm的聚四氟乙烯中。而表面介質(zhì)阻擋放電裝置則采用厚度為 2 mm 的陶瓷片作為阻擋介質(zhì)，厚度為0.2 mm 的銅片作為正負(fù)極并粘附在陶瓷片兩側(cè)，形成導(dǎo)電體-阻擋介質(zhì)-導(dǎo)電體結(jié)構(gòu)。在本文中，采用南京蘇曼的 CTP-2000K 低溫等離子體實(shí)驗(yàn)電源，放電電壓檢測采用 Tektronix P6015A 高壓探頭，示波器采用 Tektronix TBS1102。

圖1 低溫等離子體裝置示意圖Fig. 1 Schematic of cold temperature plasma generators

2.2 作用氣體

作用氣體對放電電壓、等離子體成份種類及密度等具有關(guān)鍵的影響作用。在本文中，雙介質(zhì)阻擋放電裝置采用的作用氣體氬氣(Ar)、氦氣(He)和氧氣(O2)均為高純度氣體，純度為99.99%。而惰性氣體/水汽的混合氣體則是利用惰性氣體(氬氣或氦氣)通入水溶液而獲得。懸浮式電極介質(zhì)阻擋放電裝置和表面介質(zhì)阻擋放電裝置則直接采用空氣作為作用氣體。

2.3 核糖核酸酶類型

核糖核酸酶類型繁多，本研究主要以穩(wěn)定性強(qiáng)、最難滅活的核糖核酸酶 A 作為處理對象。核糖核酸酶 A 來源于牛胰腺，屬于核糖核酸內(nèi)切酶，由 124 個(gè)氨基酸殘基和 4 對分子內(nèi)的二硫化鍵組成。本實(shí)驗(yàn)中的核糖核酸酶 A 購自 Sangon Biotech 公司的 B500474 核糖核酸酶 A 溶液，濃度為 10 mg/mL。

2.4 熒光探針

本文采用熒光法來檢測核糖核酸酶的活性。選用的熒光試劑為 6-FAM-dArUdAdA-6-TAMRA，是一種實(shí)驗(yàn)室常用的 RNase 探針，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖2所示[12]，發(fā)射波長為 490 nm，激發(fā)波長為 520 nm。當(dāng)其與核糖核酸酶混合時(shí)，P1 基團(tuán)上的 P—O 鍵容易被酶剪切斷裂成6-FAM(6-羧基熒光素)和 6-TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明)。酶的活性越強(qiáng)，P—O 鍵被剪切速度越快，產(chǎn)物 6-FAM 含量越多，熒光強(qiáng)度上升的速率則越快。因此，通過熒光強(qiáng)度變化曲率可以判斷核糖核酸酶的活性。

圖2 熒光試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)[12]Fig. 2 Chemical structure of fluorescent reagents[12]

2.5 實(shí)驗(yàn)步驟

(1)將 10 mg/mL 的核糖核酸酶 A 溶液分散在pH 7.5 的 Tris·HCl/NaCl 緩沖溶液中稀釋制得待處理溶液。其中，利用雙介質(zhì)阻擋放電裝置處理的待處理溶液濃度為 0.1 μg/mL，利用懸浮電極式介質(zhì)阻擋放電裝置和表面介質(zhì)阻擋介質(zhì)放電裝置處理的待處理溶液濃度均為 10 μg/mL。

(2)取 30 μL 濃度為 0.1 μg/mL 的待處理液放置于 200 μL 離心管中，取 10 μL 濃度為 10 μg/mL的待處理液放置于經(jīng)滅菌無酶的 2 cm×2 cm 蓋玻片中干燥待用。

(3)將上述(2)中含 0.1 μg/mL 核糖核酸酶 A溶液的離心管移至雙介質(zhì)阻擋放電裝置噴嘴下方，調(diào)整液面與噴嘴的距離為 15 mm，設(shè)置放電電壓為 12 kV，按設(shè)定時(shí)間進(jìn)行處理。

(4)取上述(2)中含有核糖核酸酶 A 溶液的蓋玻片放置于無菌玻璃片上，調(diào)整懸浮電極式介質(zhì)阻擋放電裝置放電面與蓋玻片的距離為 3 mm，設(shè)置放電電壓為 12 kV。按設(shè)定時(shí)間處理后將蓋玻片放置于含有 10 mL pH 7.5 的 Tris·HCl/NaCl 緩沖溶液的離心管進(jìn)行浸泡，使蓋玻片上的核糖核酸酶 A 溶液充分分散在緩沖液中。

(5)取上述(2)中含有核糖核酸酶 A 溶液的蓋玻片并用夾子夾持，調(diào)整表面介質(zhì)阻擋放電裝置放電面與蓋玻片的距離為 1 mm，設(shè)置放電電壓為 12 kV。按設(shè)定時(shí)間處理后將蓋玻片放置于含有 10 mL pH 7.5 的 Tris·HCl/NaCl 緩沖溶液的離心管進(jìn)行浸泡，使蓋玻片上的核糖核酸酶 A 溶液充分分散在緩沖液中。

(6)取 20 μL 上述(3)、(4)和(5)中的核糖核酸酶 A 溶液，將其加到 6-FAM-dArUdAdA-6-TAMRA 熒光探針中，使用日立 F-4600 熒光分光光度計(jì)測得熒光強(qiáng)度，以此判斷核糖核酸酶 A 的活性。

3 結(jié)果與討論

3.1 作用氣體類型對核糖核酸酶 A 活性的影響

低溫等離子體中含有大量的自由基、活性基團(tuán)、帶電粒子等，能夠有效地破壞核糖核酸酶的二硫化鍵結(jié)構(gòu)，使得酶蛋白發(fā)生變性引起失活[11]。低溫等離子體處理核糖核酸酶的效率主要取決于自由基、活性粒子等成份的濃度。

由圖3 可以看出，雙介質(zhì)阻擋放電裝置產(chǎn)生的等離子體射流對核糖核酸酶 A 溶液具有明顯的滅活作用。從熒光強(qiáng)度上升的速率可以看出，處理時(shí)間為 1 min 時(shí)，核糖核酸酶 A 出現(xiàn)失活或活性降低現(xiàn)象。隨著作用時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度上升速率呈逐漸降低趨勢，這是由于隨著作用時(shí)間的增加，大量的酶已經(jīng)失活或活性降低，導(dǎo)致其剪切熒光探針上 P—O 鍵的效率也降低。對比圖3(a)、(c)、(e)和(b)、(d)、(f)可以得出，作用氣體中含氦氣產(chǎn)生的等離子體滅活核糖核酸酶 A 的效果優(yōu)于含氬氣，作用 5 min 基本可完全滅活。這是由于氦氣放電初始電壓低于氬氣，在相同的放電電壓下，氦氣等離子體產(chǎn)生的活性粒子密度比較高。此外，由圖3 還可以看出，作用氣體中混有氧氣或者水汽的滅活效果優(yōu)于單一惰性氣體。這是因?yàn)橄鄬ψ饔脝我欢栊詺怏w而言，作用氣體中含有氧氣或水汽，產(chǎn)生的等離子體中含有較高濃度的活性氧粒子、羥基等功能團(tuán)，能夠更高效地破壞核糖核酸酶 A 結(jié)構(gòu)上的 4 對二硫化鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破損，從而使其失活。

3.2 等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)對核糖核酸酶 A 活性的影響

低溫等離子體的成份種類及濃度不僅受到作用氣體類型的影響，同時(shí)也會受到發(fā)生器結(jié)構(gòu)的限制?？紤]實(shí)際應(yīng)用的需求，本文探討了兩種可實(shí)現(xiàn)大面積處理的懸浮電極式介質(zhì)阻擋放電裝置(FE-DBD)和表面介質(zhì)阻擋放電裝置(SDBD)對核糖核酸酶 A 滅活的影響。

由圖4可以看出，F(xiàn)E-DBD 和 SDBD 兩種等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)對核糖核酸酶 A 均具有明顯的滅活作用。FE-DBD 等離子體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的等離子體處理 3 min 后，測得熒光強(qiáng)度沒有明顯的變化，說明核糖核酸酶 A 已經(jīng)失活；而 SDBD 等離子體結(jié)構(gòu)則需要處理 5 min。在相同放電電壓和作用時(shí)間條件下，F(xiàn)E-DBD 結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的等離子體滅活核糖核酸酶 A 的效果優(yōu)于 SDBD 結(jié)構(gòu)。

4 與國內(nèi)外相似研究對比分析

核糖核酸酶性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱、耐酸、耐堿，且具有強(qiáng)的生物學(xué)活性，很容易使 RNA 分解，這不僅容易造成實(shí)驗(yàn)室生物污染，同時(shí)在一定程度上限制了分子生物技術(shù)——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的發(fā)展。然而針對核糖核酸酶去除的研究比較少。曹文俊等[13]利用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡去除樣品的核糖核酸酶。熊毅等[14]利用氧釩核糖核苷復(fù)合物(RVC)抑制核糖核酸酶的活性，發(fā)現(xiàn)濃度為 10 mmol/L 的 RVC可以抑制 40 μg 核糖核酸酶。而 Lackmann 等[11]利用 DBD 等離子體對核糖核酸酶進(jìn)行滅活作用，結(jié)果表明，等離子體對核糖核酸酶水溶液作用 30 s 后活性降低 50% 以上，作用 300 s 后酶基本失活。對比現(xiàn)有研究，本文主要對大氣壓低溫等離子體滅活核糖核酸酶的影響參數(shù)展開研究，分析了作用氣體類型和等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)對核糖核酸酶 A 滅活的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，混有氧氣或水汽的作用氣體滅活效果優(yōu)異于單一惰性氣體，且 FE-DBD 等離子體發(fā)生器結(jié)構(gòu)滅活效果較佳，作用 3 min 即可完全滅活核糖核酸酶 A。

5 結(jié)論與展望

本文主要從作用氣體類型和發(fā)生器結(jié)構(gòu)兩個(gè)方面研究了大氣壓低溫等離子體對核糖核酸酶 A滅活的影響。結(jié)果表明，大氣壓低溫等離子體能夠有效滅活核糖核酸酶 A，且作用氣體類型和發(fā)生器結(jié)構(gòu)對滅活效果起著重要影響作用。作用氣體中混有氧氣或水汽能夠明顯增強(qiáng)核糖核酸酶 A的滅活能力。相對于 SDBD 等離子體發(fā)生器，F(xiàn)E-DBD 等離子體發(fā)生器產(chǎn)生的等離子體對核糖核酸酶 A 的滅活效果更佳。

核糖核酸酶污染是目前實(shí)驗(yàn)室潔凈面臨的重要挑戰(zhàn)之一，雖然已有相關(guān)研究證明等離子體技術(shù)能夠有效地滅活核糖核酸酶，但主要是針對酶溶液處理。如何將等離子體技術(shù)切實(shí)應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)室酶污染體滅活是后續(xù)推廣重點(diǎn)考慮的方向，如酶污染槍頭、酶污染實(shí)驗(yàn)臺等滅活，等離子體大面積滅活酶相關(guān)儀器的開發(fā)和設(shè)計(jì)等。