黃文金 盧翠萍 陳 琴 郭寶玲 鄭俊瓊

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬龍巖市第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福建 龍巖 364000)

宮頸癌的發(fā)病率和死亡率在女性患者中逐年增高。目前，宮頸癌的治療手段仍以手術(shù)切除和化療為主，但是由于耐藥性的多發(fā)使得宮頸癌的治療效果不理想，嚴(yán)重影響宮頸癌患者的生存年限和生活質(zhì)量〔1〕。因此，如何有效解決宮頸癌化療藥耐藥是目前最關(guān)鍵的問(wèn)題〔2〕。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC)G2的高表達(dá)是造成多種腫瘤發(fā)生多藥耐藥的重要因素之一，宮頸癌細(xì)胞中的ABCG2也處于高表達(dá)狀態(tài)〔3〕。若能夠成功下調(diào)ABCG2的表達(dá)，可能有效提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性，增強(qiáng)腫瘤的化療效果〔4〕。本研究旨在探索干擾ABCG2的表達(dá)對(duì)耐藥細(xì)胞化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 普通HeLa細(xì)胞與HeLa/MMC細(xì)胞株均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究所。HeLa/MMC細(xì)胞系對(duì)MMC表現(xiàn)出5.02倍耐藥，對(duì)順鉑有交叉耐藥，對(duì)5-氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、 阿霉素敏感。

1.2試劑 絲裂霉素購(gòu)自協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社(日本),RIPA、MTT購(gòu)Sigma公司(美國(guó))，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于北京化工廠(分析純)，總RNA提取試劑盒購(gòu)、qRT- PCR試劑盒均購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司(美國(guó))。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與生長(zhǎng)曲線的繪制 普通HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液(含10 %滅活的胎牛血清和1 %雙抗)中，耐藥細(xì)胞HeLa/MMC培養(yǎng)于含MMC的RPMI1640完全培養(yǎng)液中,培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃、5%CO2、飽和濕度，HeLa/MMC細(xì)胞在使用前1 w進(jìn)行無(wú)MMC培養(yǎng)。生長(zhǎng)曲線繪制方法：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，傳代、消化后制成細(xì)胞懸液；細(xì)胞計(jì)數(shù)后將相同數(shù)量的細(xì)胞分別接種于24孔培養(yǎng)板的各孔內(nèi)，每隔1 d消化3孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算平均值，隔天更換培養(yǎng)液；以時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)為縱軸，描繪該細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。后續(xù)研究均取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2重組慢病毒Ad-ABCG2-siRNA的構(gòu)建 根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)靶向ABCG2 基因的shDNA序列,經(jīng)公司篩選并進(jìn)行合成。目標(biāo)shDNA的兩端含限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的粘末端，可與雙酶切后的質(zhì)粒載體pGPU6/GFP/Neo結(jié)合。然后將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌內(nèi)，培養(yǎng)后挑選單克隆進(jìn)行PCR鑒定，選取陽(yáng)性結(jié)果的菌群測(cè)序送檢。序列對(duì)比無(wú)誤后將重組質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染過(guò)程使用無(wú)血清培養(yǎng)基，6 h后更換完全培養(yǎng)基(含 6%胎牛血清)。培養(yǎng)72 h后收集培養(yǎng)液上清，制成病毒懸液備用。

1.3.3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立 將HeLa/MMC細(xì)胞接種于24孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5.2×104個(gè)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入濃縮后的病毒懸液以及輔助轉(zhuǎn)染的相關(guān)試劑(5 μg/ml),陰性對(duì)照組加入NC-siRNA病毒懸液，空白對(duì)照組不做處理。感染24 h后更換完全培養(yǎng)液，72 h后觀察細(xì)胞中的熒光蛋白表達(dá)情況。

1.3.4ABCG2的表達(dá)測(cè)定 首先使用qRT-PCR方法測(cè)定mRNA的表達(dá)水平?？俁NA提取參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，提取后用Nanodrop-2000測(cè)定濃度，瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定純度。qRT-PCR的反應(yīng)體系參考逆轉(zhuǎn)擴(kuò)增一步法試劑盒說(shuō)明書，逆轉(zhuǎn)錄溫度42℃，時(shí)間60 min，PCR程序設(shè)定為94℃ 2 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。紫外成像并使用掃描儀進(jìn)行半定量分析(以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參)；利用Western印跡方法進(jìn)行蛋白表達(dá)水平的測(cè)定。提取各組細(xì)胞的蛋白，經(jīng)聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法定量后使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉后加入一抗置于搖床上4℃過(guò)夜，沖洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，1 h后顯影。

1.3.5MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa/MMC細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)的HeLa/MMC細(xì)胞系細(xì)胞,計(jì)數(shù)后種于不同的96孔培養(yǎng)板中,每孔2.3× 104個(gè),分別設(shè)置空白組、不給藥組以及實(shí)驗(yàn)組，其中7個(gè)實(shí)驗(yàn)組MMC的給藥濃度如下：0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L，不給藥組加入相應(yīng)量的培養(yǎng)液。 37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h后用MTT處理。每孔加MTT 溶液(5 mg/ml)100 μl，培養(yǎng)4 h后，每孔加DMSO 100 μl，充分振蕩后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570。計(jì)算各組細(xì)胞抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組OD570-空白組OD570)/(對(duì)照組OD570-空白組OD570)× 100%。做量效曲線并進(jìn)行直線回歸,求半數(shù)有效劑量IC50，化療敏感性提高倍數(shù)=HeLa/MMC細(xì)胞IC50/穩(wěn)定表達(dá)的HeLa/MMC細(xì)胞IC50-1。

1.3.6流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞的凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa/MMC細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)的HeLa/MMC細(xì)胞系細(xì)胞,計(jì)數(shù)后種于6孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)過(guò)夜給藥，MMC的終濃度為0.4 mg/L，在給藥48 h后進(jìn)行細(xì)胞收集,洗滌后加入PI混勻,室溫避光孵育30 min后及時(shí)上機(jī)檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1ABCG2的表達(dá)測(cè)定 qRT-PCR結(jié)果顯示，內(nèi)參的RNA條帶灰度值基本一致，而ABCG2 mRNA的表達(dá)存在組間差異，其中HeLa/MMC細(xì)胞組的ABCG2-mRNA表達(dá)量(0.975 4)最高，其次是普通的HeLa細(xì)胞組(0.784 2)，而被轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定表達(dá)的HeLa/MMC細(xì)胞組的ABCG mRNA表達(dá)量最低(0.378 6)。此結(jié)果說(shuō)明被轉(zhuǎn)染后的HeLa/MMC細(xì)胞中的ABCG2在mRNA水平上被成功下調(diào)。

Western印跡結(jié)果顯示，內(nèi)參的表達(dá)基本一致，而ABCG2蛋白的表達(dá)存在組間差異，其中HeLa/MMC細(xì)胞組的ABCG2蛋白表達(dá)量最高(0.954 3)，其次是普通的HeLa細(xì)胞組(0.784 2)，而被轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定表達(dá)的HeLa/MMC細(xì)胞組的ABCG2蛋白表達(dá)量最低(0.457 6)。此結(jié)果說(shuō)明，被轉(zhuǎn)染后的HeLa/MMC細(xì)胞中的ABCG2蛋白表達(dá)被成功下調(diào)，此結(jié)果與上述qRT-PCR結(jié)果相吻合。

2.2細(xì)胞增殖抑制率 經(jīng)不同濃度的絲裂霉素處理后，ABCG2表達(dá)下調(diào)的HeLa/MMC細(xì)胞組(實(shí)驗(yàn)組)的細(xì)胞抑制率明顯高于未經(jīng)干擾的HeLa/MMC細(xì)胞組(對(duì)照組)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。說(shuō)明干擾ABCG2表達(dá)可以增強(qiáng)絲裂霉素對(duì)HeLa/MMC細(xì)胞增殖的抑制作用。

表1 各組細(xì)胞在不同濃度的MMC作用下的抑制率

與HeLa/MMC細(xì)胞組比較：1)P<0.05

圖1 抑制率-藥物濃度曲線(量效曲線)

根據(jù)量效曲線做直線回歸計(jì)算IC50值。穩(wěn)定表達(dá)組細(xì)胞的IC50值明顯減小(0.093)，HeLa/MMC細(xì)胞組為0.411。根據(jù)增敏倍數(shù)公式計(jì)算出HeLa/MMC細(xì)胞對(duì)MCC的敏感性提高3.42倍。進(jìn)一步證實(shí)下調(diào)ABCG2表達(dá)可以有效增強(qiáng)HeLa細(xì)胞的化療敏感性。

2.3細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，ABCG2表達(dá)被干擾后，耐藥細(xì)胞HeLa/MMC細(xì)胞的凋亡率明顯增加，48 h凋亡率為(35.6±1.1)%，而未經(jīng)重組慢病毒Ad-ABCG2-siRNA轉(zhuǎn)染的耐藥細(xì)胞株HeLa/MMC的凋亡率為(15.3±2.3)%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，下調(diào)ABCG2蛋白的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞HeLa/MMC的凋亡，即增強(qiáng)絲裂霉素對(duì)HeLa細(xì)胞的促凋亡作用。這是下調(diào)ABCG2蛋白可增強(qiáng)HeLa/MMC細(xì)胞對(duì)絲裂霉素的化療敏感性的機(jī)制之一。

3 討 論

隨著基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的發(fā)展，腫瘤治療的研究也隨之有所深入，其中腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及腫瘤耐藥機(jī)制的研究引起越來(lái)越多的重視〔5〕。宮頸癌是婦科常見(jiàn)腫瘤，發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，同時(shí)伴隨發(fā)病年輕化趨勢(shì)〔6，7〕。目前手術(shù)和化療仍是宮頸癌治療的重要手段，而如何有效預(yù)防切除術(shù)后的復(fù)發(fā)和化療藥物的耐藥性是克服宮頸癌治療難題的關(guān)鍵〔8，9〕。隨著腫瘤的多藥耐藥分子機(jī)制的探究，越來(lái)越多潛在的逆轉(zhuǎn)耐藥性靶點(diǎn)被揭示，ABCG2蛋白便是其中之一。ABCG2蛋白是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2蛋白，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，它是一種可以識(shí)別、結(jié)合并水解ATP的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是細(xì)胞抵御外來(lái)物質(zhì)的一種功能蛋白，可利用ATP水解釋放的能量將藥物等外來(lái)化合物泵出細(xì)胞〔10，11〕。研究發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的發(fā)生都與細(xì)胞中的ABCG2蛋白高表達(dá)相關(guān)〔12〕。因此，抑制或者下調(diào)腫瘤細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)是逆轉(zhuǎn)耐藥性的重要機(jī)制之一。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，可采取RNA干擾技術(shù)實(shí)現(xiàn)高效特異穩(wěn)定地下調(diào)目的蛋白表達(dá)。其中siRNA是一類可以特異性水解靶標(biāo)mRNA的非編碼RNA，在基因沉默過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔13，14〕。

綜上所述，下調(diào)ABCG2的表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞具有化療增敏作用，其機(jī)制與下調(diào)ABCG2蛋白的表達(dá)可促進(jìn)耐藥細(xì)胞HeLa/MMC的凋亡有關(guān)。