陳曉玲 彭 毅

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，新疆 石河子 832000)

腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)和生理功能異常引發(fā)的蛋白尿是腎損傷患者的主要臨床特征，而足細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的裂孔隔膜和足突是腎小球?yàn)V過屏障的主要成分〔1〕。足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)的破壞是多種原發(fā)或繼發(fā)腎臟疾病蛋白尿發(fā)生與發(fā)展的主要因素〔2〕；因此，修復(fù)并維持足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能是腎臟疾病治療的關(guān)鍵。相關(guān)研究顯示，足細(xì)胞中瞬時受體電位陽離子通道(TRPC)6及其介導(dǎo)的上、下游信號通路與蛋白尿相關(guān)〔3〕。整合素連接激酶(ILK)是足細(xì)胞中肌動蛋白與整合蛋白相互連接的骨架，可能參與調(diào)控腎小球?yàn)V過屏障功能〔4〕。本實(shí)驗(yàn)觀察以蛋白尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)的腎損傷患者腎小球中TRPC6、ILK表達(dá)和分布情況，并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1腎組織收集 收集2016年1月至2017年6月間在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院行腎臟穿刺活檢且24 h尿蛋白>1 g的患者腎組織標(biāo)本共25例。選取同期因腫瘤、外傷等原因切除的腎組織標(biāo)本為對照組10例，均無蛋白尿。上述標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋，3 μm連續(xù)切片，分別行蘇木素-伊紅(HE)和免疫組化染色。

1.2主要材料與試劑 人原代腎足細(xì)胞購于上海晶抗生物工程有限公司；胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、重組γ干擾素購于江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司；兔抗人TRPC6多克隆抗體和ILK多克隆抗體購于上海信裕生物科技有限公司；脂質(zhì)體2000、pcDNA3.1-TRPC6質(zhì)粒購于上海依赫生物科技有限公司。

1.3免疫組化染色 高溫修復(fù)抗原，滅活過氧化物酶，羊血清封閉腎組織標(biāo)本；滴加1∶500倍稀釋的TRPC6、ILK抗體，4℃孵育過夜，剩余步驟按試劑盒說明進(jìn)行；磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照，試劑盒公司提供陽性對照。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)中存在黃褐色顆粒為陽性，依據(jù)陽性細(xì)胞染色情況進(jìn)行半定量分析。

1.4人原代腎足細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)人原代腎足細(xì)胞。向培養(yǎng)基中滴加10 U/ml的重組γ干擾素，33℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，觀察細(xì)胞增殖面積占培養(yǎng)皿表面50%以上時，將細(xì)胞放于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中，使用DMEM完全培養(yǎng)基孵育8～12 d。用10-7mol/L的阿霉素誘導(dǎo)成熟的人原代腎足細(xì)胞12、24、36 h。通過脂質(zhì)體2000將pcDNA3.1-TRPC6質(zhì)粒、pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)入人原代腎足細(xì)胞建立TRPC6過表達(dá)組、陰性對照組，以僅加脂質(zhì)體2000的為空白對照組，轉(zhuǎn)染48 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5Western印跡檢測TRPC6、ILK蛋白表達(dá) 蛋白質(zhì)提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定濃度。取80 μg蛋白行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉非特異性抗原2 h，滴加兔抗人TRPC6多克隆抗體(1∶500)、兔抗人ILK多克隆抗體(1∶500)，選用兔源性β-actin多克隆抗體(1∶1 000)為內(nèi)參，4℃孵育過夜；洗膜后滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫下反應(yīng)1 h。電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，凝膠成像系統(tǒng)讀取目標(biāo)條帶灰度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1腎組織中TRPC6和ILK表達(dá)情況 TRPC6和ILK在正常腎組織和各類慢性腎病的腎小球中均有表達(dá)。TRPC6多表達(dá)于足細(xì)胞中，ILK除足細(xì)胞外也在系膜區(qū)表達(dá)。在膜性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥、狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病的腎小球中TRPC6表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于正常腎組織(P<0.05)；在高血壓腎損傷組織中，TRPC6表達(dá)強(qiáng)度與正常腎組織之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。局灶節(jié)段性腎小球硬化癥、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病的腎小球中ILK表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于正常腎組織(P<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 正常腎組織和各類型腎臟損傷組織中TRPC6表達(dá)(免疫組化染色，×400)

圖2 正常腎組織和各類型腎臟損傷組織中ILK表達(dá)(免疫組化染色，×400)

2.2阿霉素?fù)p傷人原代腎足細(xì)胞后TRPC6、ILK蛋白表達(dá)情況 正常對照組TRPC6蛋白相對表達(dá)量為0.35±0.08；阿霉素組誘導(dǎo)12、24、36 h，TRPC6蛋白相對表達(dá)量分別為0.41±0.09、0.68±0.12、0.79±0.15。正常對照組ILK蛋白相對表達(dá)量為0.51±0.09；阿霉素組誘導(dǎo)12、24、36 h，ILK蛋白相對表達(dá)量分別為0.65±0.13、0.79±0.16、1.16±0.23。10-7mol/L的阿霉素誘導(dǎo)24、36 h時TRPC6、ILK蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常對照組(P<0.05)。見圖3。

圖3 阿霉素?fù)p傷足細(xì)胞后TRPC6、ILK蛋白表達(dá)(Western印跡)

2.3人原代腎足細(xì)胞過表達(dá)TRPC6后對ILK蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染48 h后TRPC6過表達(dá)組人原代腎足細(xì)胞TRPC6蛋白相對表達(dá)量為0.71±0.25，明顯高于陰性對照組和空白對照組的0.45±0.13、0.38±0.09(P<0.05)；TRPC6過表達(dá)組ILK蛋白相對表達(dá)量為0.85±0.17，明顯高于陰性對照組和空白對照組的0.60±0.11、0.55±0.13(P<0.05)；陰性對照組和空白對照組TRPC6、ILK蛋白相對表達(dá)量之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 足細(xì)胞過表達(dá)TRPC6后ILK的蛋白表達(dá)(Western印跡)

3 討 論

TRPC6屬于瞬時受體電位超家族成員，參與調(diào)控足細(xì)胞傳導(dǎo)通路以及維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)。當(dāng)其發(fā)生突變后可引發(fā)腎病綜合征、蛋白尿，病理提示為局灶節(jié)段性腎小球硬化性改變。相關(guān)研究顯示，在膜性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥、微小病變性腎病等腎小球疾病中均可檢測出TRPC6表達(dá)上調(diào)，且上述疾病臨床癥狀均以蛋白尿?yàn)橹鳌?〕。研究已發(fā)現(xiàn)TRPC6可損傷足細(xì)胞，進(jìn)而在蛋白尿和腎小球病變中發(fā)揮重要作用〔6〕。正常狀態(tài)下足細(xì)胞TRPC6的活性很低，經(jīng)轉(zhuǎn)染修飾或物理增壓后可明顯提升其活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除高血壓腎損傷外，其他類型腎損傷組織(膜性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化癥等)腎小球中TRPC6表達(dá)水平較正常腎組織明顯提升，且在光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)為足突不同程度融合，提示TRPC6異常表達(dá)與足細(xì)胞損傷引發(fā)的蛋白尿有關(guān)。

ILK為絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過多種信號傳導(dǎo)通路參與細(xì)胞增殖、遷移等過程。當(dāng)其表達(dá)上調(diào)后可引發(fā)足細(xì)胞突變，引發(fā)蛋白尿。在腎小球疾病、糖尿病腎病等多種蛋白尿性腎病動物模型中均存在ILK異常表達(dá)，抑制ILK表達(dá)可有效改善蛋白尿癥狀。使用基因敲除技術(shù)處理ILK基因后，小鼠足細(xì)胞生理功能和結(jié)構(gòu)完整性被破壞〔7〕。上述研究提示ILK可參與腎小球屏障功能調(diào)控，但目前ILK表達(dá)很少在腎組織活檢中被提及。本實(shí)驗(yàn)顯示，TRPC6、ILK在腎小球中表達(dá)部位均位于足細(xì)胞，在局灶節(jié)段性腎小球硬化癥和糖尿病腎病這兩種發(fā)病率較高的足細(xì)胞腎病中，ILK表達(dá)水平與TRPC6呈正相關(guān)，提示TRPC6、ILK可能共同參與足細(xì)胞腎病的發(fā)生、發(fā)展，但二者之間的關(guān)聯(lián)仍不明確。