賀映俠 朱 虹

(武漢市中心醫(yī)院老年科，湖北 武漢 430000)

2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究表明活性氧(ROS)大量累積后加重胰島 β 細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，并通過磷酸化胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶蛋白、上調(diào)炎性因子表達(dá)等方式介導(dǎo)肝臟、脂肪、肌肉組織胰島素抵抗(IR)，在糖尿病(DM)發(fā)展的各個(gè)階段起到重要作用〔1～3〕。氧化應(yīng)激可能密切參與T2DM的發(fā)病過程。去乙?；?SIRT)3是一種線粒體蛋白，通過對(duì)線粒體內(nèi)相關(guān)乙?；鞍兹ヒ阴；饔玫确绞綔p少細(xì)胞ROS水平，SIRT3的特性主要表現(xiàn)在能夠使超氧化物歧化酶(SOD)的活性上升，促使細(xì)胞自由基水平降低和機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力提高〔4,5〕。黃芪多糖(APS)是從豆科植物黃芪中提取的大分子復(fù)合物〔6〕。研究表明，APS治療DM有較好的效果，其機(jī)制可能與增強(qiáng)胰島素功效、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平、預(yù)防糖尿病并發(fā)癥有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚〔7〕。那么，APS改善DM患者病情能否通過升高SIRT3的表達(dá)和提高機(jī)體的氧化應(yīng)激能力實(shí)現(xiàn)尚未明確。本文旨在探討APS對(duì)T2DM大鼠骨骼肌中SIRT3 mRNA表達(dá)、氧化應(yīng)激因子水平及蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1材料和試劑 APS購自天津賽諾制藥有限公司，鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司，SOD、丙二醛(MDA)、ROS、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)和胰島素試劑盒購自南京建成生物工程研究所，血糖儀和血糖測定試紙由美國羅氏診斷公司提供，逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒由日本Takara公司提供；美國Santa Cruz公司生產(chǎn)的SIRT3抗體，考馬斯亮藍(lán)試劑盒和電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影液購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組方法 SD大鼠50只，均為雄性，體重180～200 g，平均(191.78±4.63)g。取10只大鼠作為對(duì)照組，給予普通飼料喂養(yǎng)；使用高糖高脂飼料喂養(yǎng)另外40只大鼠，時(shí)間為4 w，造IR大鼠模型，然后將30 mg/kg的STZ進(jìn)行腹腔注射，而將等體積的無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射到對(duì)照組大鼠體內(nèi)。高脂飼料和普通飼料分別給予造模組和對(duì)照組大鼠，時(shí)間為2 w，檢測血糖及空腹胰島素(FINS)水平前禁食8 h，然后按照2 g/kg的劑量灌服20% D-葡萄糖溶液，進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn)，將血糖(0 min)>7.0 mmol/L和血糖(120 min)>11.0 mmol/L的大鼠判定為造模成功〔8〕。隨機(jī)將40只造模成功的大鼠分成模型組和低、中、高劑量組，每組10只。對(duì)照組和模型組均腹腔注射100 mg·kg-1·d-1的生理鹽水；APS低、中、高劑量組分別予100、200、400 mg·kg-1·d-1的APS。8 w后對(duì)所有大鼠進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)所用大鼠由武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3體重、血糖及FINS的測定 8 w后測定各組大鼠體重并且尾靜脈取血，空腹血糖采用血糖儀測定，F(xiàn)INS采用胰島素試劑盒檢測。

1.4骨骼肌組織中SOD、MDA、ROS活性及GSH含量測定 用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，心臟處取血，再行處死，將腓腸肌勻漿，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測SIRT3 mRNA的表達(dá) 用RNA保存液儲(chǔ)存骨骼肌，采用美國Invitrogen公司提供的Trizol提取骨骼肌細(xì)胞中總RNA，嚴(yán)格按照ReverTra Ace qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SIRT3的引物序列如下：上游5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′，下游5′-CCAGGGAGGAAGAGGATGCG-3′;β-actin:上游5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′，下游5′-CCAGGGAGGAAGAAGATGCG-3′ 。用日本Toyobo Co.Ltd提供的SYBR?Green Realtime PCR Master Mix定量試劑盒，應(yīng)用Roche,Light Cycler 480 Instrument RT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。內(nèi)參為β-actin，應(yīng)用2-ΔΔCt進(jìn)行半定量計(jì)算。

1.6Western印跡法檢測SIRT3蛋白表達(dá) 保持0℃的溫度，將肌肉迅速分離，1.0 ml細(xì)胞裂解液裂解肌肉組織，4℃ 15 000 r/min離心30 min，分離上清液，采用BCA法將蛋白定量至相同濃度，上樣量為40 μg/每孔，采用12% SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，PVDF膜上負(fù)載樣品，封閉液為5%脫脂奶粉，時(shí)間為1 h，加入TBST稀釋的SIRT3一抗(工作濃度1∶500)在4℃下過夜反應(yīng)，用TBST沖洗膜3次，加入二抗后，在室溫下孵育1 h，再用TBST沖洗膜3次，ECL進(jìn)行顯色，然后壓X光膠片1～5 min，顯影、定影，應(yīng)用Image J軟件統(tǒng)計(jì)條帶的灰度值，分析結(jié)果參考目的條帶與β-actin灰度值的比值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1APS對(duì)體重、血糖、FINS及SIRT3 mRNA表達(dá)的影響 各組體重、血糖、FINS及SIRT3 mRNA表達(dá)水平整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重比較：模型組體重及肌肉組織中SIRT3 mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，而血糖及FINS水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。APS干預(yù)后，三個(gè)不同劑量給藥組體重和肌肉組織中SIRT3 mRNA表達(dá)水平均明顯高于模型組，而血糖及FINS水平顯著低于模型組(均P<0.05)。高劑量組的血糖及FINS表達(dá)水平顯著低于低劑量組和中劑量組，體重和SIRT3 mRNA水平高于低劑量組和中劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組體重、血糖、FINS及SIRT3 mRNA、SOD、MDA、SOD以及ROS活性水平比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與高劑量組比較：3)P<0.05

2.2APS對(duì)SOD、MDA、GSH及ROS活性的影響 各組GSH、MDA、SOD、ROS水平整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組GSH和SOD水平明顯低于對(duì)照組，但是MDA和ROS水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。APS治療后，與模型組相比，各給藥組GSH及SOD水平明顯升高，而MDA水平顯著下降(P<0.05)，高劑量組ROS水平較模型組顯著下降(P<0.05)。其中GSH、SOD水平隨著APS劑量的升高而升高(P<0.05)；高劑量組MDA水平顯著低于低、中劑量組水平(P<0.05)，高劑量組ROS水平顯著低于低劑量組水平(P<0.05)。見表1。

2.3APS對(duì)SIRT3蛋白表達(dá)量的影響 與對(duì)照組(0.67±0.10)比較，模型組肌肉中SIRT3蛋白表達(dá)量(0.29±0.06)顯著降低，經(jīng)APS治療后，大鼠肌肉組織中SIRT3蛋白表達(dá)量顯著高于模型組(低、中、高劑量組分別為0.39±0.10，0.42±0.14，0.52±0.16；P<0.05)，但SIRT3蛋白表達(dá)量與APS之間并無劑量相關(guān)性(P>0.05)，見圖1。

1：對(duì)照組；2：模型組；3：APS低劑量組；4：APS中劑量組；5：APS高劑量組圖1 APS對(duì)大鼠SIRT3蛋白的影響

3 討 論

T2DM患者存在骨骼肌IR，降低葡萄糖的消耗量〔9〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)APS可有效降低DM大鼠的血糖、FINS水平，增加大鼠體重。既往研究認(rèn)為APS利于維持胰島β細(xì)胞的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，包括降低IR作用、穩(wěn)定血脂代謝、提升胰島素分泌量和降低血糖濃度〔8〕。數(shù)據(jù)表明，T2DM并發(fā)癥的整個(gè)發(fā)展過程中均伴隨氧化應(yīng)激〔10〕。高血糖和脂肪酸刺激ROS的產(chǎn)生，提高代謝組織對(duì)胰島素的抵抗性，使得β細(xì)胞功能衰退，增加葡萄糖的耐受量，最終誘發(fā)DM〔11〕。GSH、SOD是細(xì)胞內(nèi)重要的還原劑，能有效清除過氧化代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)〔12〕。MDA、ROS是判斷氧自由基產(chǎn)生和組織損傷的重要生物標(biāo)志物〔13〕。

本研究提示DM模型大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平顯著升高，氧化應(yīng)激可能參與DM的發(fā)病機(jī)制，而APS處理組可以顯著降低DM大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，同時(shí)減輕大鼠DM的嚴(yán)重程度，其治療作用可能與減輕體內(nèi)氧化應(yīng)激水平介導(dǎo)有關(guān)。SIRT3作為一種由線粒體產(chǎn)生且依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的去乙?；?，主要在代謝活躍的組織表達(dá)，如肌肉、肝臟、心臟和脂肪組織等，具有去乙?；富钚浴IRT3的下降或活性改變可能與肥胖及IR相關(guān)疾病的發(fā)病相關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)APS治療后T2DM大鼠骨骼肌組織SIRT3 mRNA及蛋白含量增加，同時(shí)大鼠的疾病程度有了不同程度的減輕，這表明APS能夠上調(diào)骨骼肌組織中SIRT3的表達(dá)量和抗氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而提高胰島素的敏感性，控制DM大鼠病情。研究表明，SIRT3能減少細(xì)胞內(nèi)ROS水平依賴于SOD-2，SIRT3通過去乙?；疭OD兩個(gè)關(guān)鍵的賴氨酸殘基，增強(qiáng)其抗氧化活性〔14,15〕。另外，Sundaresan等〔16〕認(rèn)為，SIRT3通過阻滯開放的方式調(diào)節(jié)位于線粒體滲透轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mPTP)中的親環(huán)蛋白。但是APS具體如何通過SIRT3調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平仍需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，APS降低DM大鼠血糖水平及IR的作用機(jī)制為緩解氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高SIRT3的表達(dá)，但是具體下游信號(hào)通路需要進(jìn)一步研究予以明確。