魏 蔚 劉玉華

(平頂山學院醫(yī)學院，河南 平頂山 467000)

肝癌是世界上對人類健康危害最大的惡性腫瘤之一，死亡率極高〔1〕。而我國是肝癌的高發(fā)地區(qū)之一，每年新增病例占全世界的一半以上〔2〕。肝癌的高死亡率主要原因是其起病隱匿、發(fā)病機制復雜、極易擴散，從而限制了肝癌患者的早期診斷和治療〔3，4〕。目前臨床上治療肝癌的主要方法仍然是手術切除，但是當患者被確診時，已是晚期，全身擴散，錯過了切除的最佳時機〔5，6〕。因此，往往需要輔以全身化療和放療。但是化療會導致肝癌的多藥耐藥性，使化療的效果大大降低而達不到預期療效〔7，8〕。尋找有效的耐藥逆轉(zhuǎn)藥物對肝癌的化療和預后具有極其重要的意義。目前國內(nèi)外研發(fā)了大量的西藥逆轉(zhuǎn)試劑，但其毒性明顯或者效果不佳而很難在臨床上推廣〔9，10〕。因此，研究者們將目光轉(zhuǎn)向了低毒高效的中藥制劑。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃的根莖中提取的一種酚類色素，據(jù)現(xiàn)有資料報道，其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的藥理作用，其對正常組織毒性低〔11～13〕。目前國內(nèi)外研究普遍認為姜黃素的抗腫瘤作用機制可能主要與抑制腫瘤細胞的生長和增殖、誘導腫瘤細胞凋亡有關〔14～16〕。此外，姜黃素可以增強化療藥物的敏感性，姜黃素可以有效逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌、非小細胞肺癌、胃癌等多藥耐藥細胞的耐藥性〔17～19〕。但是姜黃素能否逆轉(zhuǎn)肝癌細胞對耐常見化療藥物阿霉素的耐藥性，目前國內(nèi)外這方面的研究尚少。本文探討姜黃素能否逆轉(zhuǎn)人肝癌細胞株對阿霉素耐藥性及逆轉(zhuǎn)的可能機制，為肝癌的耐藥臨床逆轉(zhuǎn)提供初步的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗藥物 阿霉素(貨號：25316-40-9，含量≥99.8%，北京諾其雅生物科技有限公司)；姜黃素(貨號：458-37-7，含量≥99.5%，北京索萊寶科技有限公司)；LY294002(貨號：154447-36-6，含量≥99%，北京啟維益成科技有限公司)。

1.2主要試劑 MTT細胞活力檢測試劑盒購買于上海中喬新舟生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶消化液、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購買自美國HyClone公司；二甲基亞砜(DMSO)、Annexin-V FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海阿拉丁生物試劑公司；磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(Akt)蛋白抗體購買于美國Neomarker公司；β-actin抗體購買于美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物標記的二抗購買于武漢博士德生物公司；電化學發(fā)光(ECL)試劑及其他蛋白質(zhì)印跡實驗試劑均購買上海阿拉丁試劑公司。

1.3細胞系與動物腫瘤模型構(gòu)建 人肝癌細胞株Bel7402購買于上海細胞庫，采用常規(guī)細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)。人肝癌耐藥細胞株Bel7402/ADR在本實驗室中采用阿霉素藥物濃度遞增法誘導獲得。取對數(shù)生長期Bel7402細胞，接種于培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為含10 μg/ml阿霉素的新鮮培養(yǎng)基，并持續(xù)培養(yǎng)3 d，然后棄掉上清和死亡漂浮的細胞，重復上述步驟，培養(yǎng)2個月后，將細胞放入含0.1 μg/ml阿霉素的培養(yǎng)基中穩(wěn)定培養(yǎng)，獲得Bel7402/ADR細胞。Balb/c裸鼠(3～5周齡，雌性，15～20 g，SPF級)購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養(yǎng)于SPF級動物房中。取對數(shù)生長期Bel7402/ADR細胞，消化后用PBS重懸細胞，并以106/ml的細胞密度接種到小鼠后背皮下，每只注射150 μl含細胞PBS，放動物房中繼續(xù)飼養(yǎng)。大約10 d后，用游標卡尺測量腫瘤大小，腫瘤體積=長×寬2÷2。腫瘤大小大約為80 mm3時用于后續(xù)試驗。

1.4實驗方法

1.4.1MTT法檢測細胞活性 取對數(shù)生長期Bel7402和Bel7402/ADR細胞，消化后分別以105/ml密度接種到96孔板中培養(yǎng)24 h，棄掉舊培養(yǎng)，分別加入含不同濃度阿霉素和姜黃素及阿霉素和姜黃素聯(lián)合藥物的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每個實驗組4個復孔，棄掉含藥培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液(濃度為5 mg/ml)50 μl培養(yǎng)4 h，小心棄去上清，每孔加入200 μl DMSO，震蕩溶解沉淀，酶標儀在波長492 nm下讀取吸光度值。計算藥物對兩種細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)值及耐藥指數(shù)(KI)。RI=IC50(Bel7402/ADR)/IC50(Bel7402)。

1.4.2細胞凋亡檢測 實驗分為阿霉素組、5 μg/ml姜黃素組、10 μg/ml姜黃素組，每個實驗組4個復孔。將姜黃素和阿霉素加入對數(shù)生長期的各組細胞中，培養(yǎng)24 h后，用胰酶消化液消化細胞，通過離心(1 500 r/min，3 min)收集細胞。所得細胞按細胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟操作，PBS洗細胞2次后，加入400 μl預冷PBS，然后分別加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，4℃避光孵育30 min后，立即用流式細胞儀測定，經(jīng)計算機軟件處理后，計算出凋亡細胞的百分率。

1.4.3Western印跡檢測細胞中PI3K/Akt蛋白表達水平 取對數(shù)生長期Bel7402和Bel7402/ADR細胞，以104/ml密度接種到培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h，每個實驗組3個復瓶。實驗分為5個組：Bel7402細胞組、Bel7402/ADR細胞+阿霉素組、素霉素+LY294002組、阿霉素+5 μg/ml姜黃素組、阿霉素+10 μg/ml 姜黃素組。培養(yǎng)24 h后，棄掉舊培養(yǎng)液，消化細胞并通過低速離心收集細胞，提取細胞總蛋白。采用Bradford方法進行蛋白定量，煮沸樣本5 min，冰上冷卻后離心30 s，取上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓100 V下轉(zhuǎn)膜1 h，使用0.5%(W/V)脫脂牛奶室溫封閉聚偏二氟乙烯(PVDF)膜1 h，在4℃下，用PI3K和Akt蛋白一抗孵育過夜，再用0.1%(V/V)TBST洗膜2次后，在室溫下，孵育熒光素標記的二抗1 h，洗膜3次后即用ECL顯色劑曝光，并用掃膜儀進行成像。

1.4.4姜黃素對Bel7402/ADR荷瘤鼠腫瘤治療的檢測 將Bel7402/ADR荷瘤鼠隨機分為四組：生理鹽水組、阿霉素組、5 μg/ml姜黃素組、10 μg/ml姜黃素組。分別通過小鼠尾靜脈給藥，給藥后，每隔2 d檢測一次小鼠腫瘤體積，并對小鼠進行稱重。

1.4.5在體組織學檢測 荷瘤鼠經(jīng)過不同藥物處理30 d后，處死小鼠，取出主要臟器，包括心、肝、脾、肺、腎。立即用10%甲醛溶液浸泡過夜，不同體積濃度的無水乙醇脫水后，將組織塊浸泡到二甲苯中30 min。再將組織塊浸泡在50～60℃的石蠟中2 h，然后和石蠟一起倒入包埋框里，待冷卻后，放入石蠟切片機切片，厚度為5 mm。最后用蘇木精和伊紅分別進行染色，并在光學顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)，數(shù)碼相機拍照。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MTT法檢測Bel7402/ADR細胞對阿霉素的敏感性 阿霉素對Bel7402和Bel7402/ADR細胞的IC50值分別為(62.3±3.1)和(1 514.6±12.6)μg/ml，Bel7402/ADR對阿霉素表現(xiàn)了高度的耐藥性，RI為24.3。

2.2姜黃素對Bel7402/ADR細胞活性的影響 如表1所示，0～100 μg/ml姜黃素對Bel7402和Bel7402/ADR細胞活性均有濃度依賴性抑制效果。姜黃素對Bel7402和Bel7402/ADR細胞的IC50值分別為：(95.8±3.9)μg/ml和(101.4±3.1)μg/ml。本實驗中規(guī)定細胞抑制率小于10%的藥物劑量為無毒劑量，因此姜黃素對Bel7402/ADR細胞的無毒劑量為5和10 μg/ml。

2.3姜黃素對Bel7402/ADR細胞耐藥逆轉(zhuǎn)的作用 無毒劑量5 μg/ml和10 μg/ml姜黃素分別聯(lián)合阿霉素對Bel7402/ADR細胞的IC50值分別為(769.4±14.9)和(431.8±9.8)μg/ml，對Bel7402/ADR的耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.97和3.51倍，隨著姜黃素濃度的提高，逆轉(zhuǎn)效果越明顯。

表1 姜黃素對Bel7402/ADR細胞活性的影響

與0 μg/ml組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率 阿霉素幾乎不能誘導Bel7402/ADR細胞凋亡〔凋亡率為(3.9±1.2)%〕，分別聯(lián)合無毒劑量5和10 μg/ml姜黃素后，誘導的凋亡率分別為(15.8±2.4)%和(27.3±1.9)%，說明姜黃素逆轉(zhuǎn)了Bel7402/ADR細胞的耐藥性，并誘導細胞凋亡。

2.5Western印跡檢測PI3K/Akt蛋白的表達 如圖1所示，Bel7402細胞中PI3K/Akt蛋白的表達含量很少，顯著低于Bel7402/ADR細胞中的表達含量(P<0.01)。用PI3K/Akt蛋白表達抑制劑LY294002預處理Bel7402/ADR細胞后，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt蛋白的表達被顯著抑制(P<0.01)。Bel7402/ADR細胞分別加上5和10 μg/ml姜黃素處理24 h后，細胞內(nèi)PI3K/Akt蛋白的表達含量隨著姜黃素的升高而降低，相比單獨的Bel7402/ADR細胞中的PI3K/Akt蛋白的表達含量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)，見表2。

圖1 各組細胞中PI3K/AKT蛋白的表達比較

PI3KAKTBel7402細胞0.12±0.062)0.15±0.0452)Bel7402/ADR細胞 阿霉素組0.89±0.090.75±0.078 LY294002組0.24±0.0582)0.21±0.0242) 5 μg/ml姜黃素組0.56±0.0351)0.37±0.0162) 10 μg/ml姜黃素組0.35±0.0322)0.29±0.0242)

與阿霉素組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.6姜黃素聯(lián)合阿霉素體內(nèi)抑制皮下移植瘤的作用 如圖2所示，單獨的阿霉素處理荷瘤小鼠，對小鼠的腫瘤生長基本沒有抑制作用，說明在體Bel7402/ADR細胞對阿霉素具有很強的耐藥性。聯(lián)合無毒劑量5和10 μg/ml姜黃素后，腫瘤體積得到顯著抑制，隨著姜黃素的濃度升高，抑制效果愈加顯著(P<0.01)。

2.7姜黃素聯(lián)合阿霉素體內(nèi)對小鼠的毒理學研究 通過檢測小鼠體重來反映藥物對小鼠健康的影響，如圖3所示，單獨的阿霉素、5 μg/ml姜黃素、10 μg/ml姜黃素對小鼠體重增長均無明顯影響。30 d的治療期接受后，單獨的阿霉素、5 μg/ml姜黃素、10 μg/ml姜黃素對小鼠主要臟器均無明顯損傷(圖4，5)，說明，本實驗中采用的藥物劑量均在安全范圍之內(nèi)。

與阿霉素組比較:1)P<0.01圖2 姜黃素聯(lián)合阿霉素對腫瘤體積的影響

圖3 姜黃素聯(lián)合阿霉素對小鼠體重的影響

圖4 姜黃素聯(lián)合阿霉素對小鼠心臟組織的影響(HE，×100)

圖5 HE染色檢測姜黃素聯(lián)合阿霉素對小鼠肝臟、脾臟、肺、腎臟組織的影響(HE，×100)

3 討 論

細胞耐藥是指腫瘤細胞對抗腫瘤藥物產(chǎn)生很強的抗藥性，從而大大降低化療藥物的治療效果〔20，21〕。阿霉素是一種廣譜的抗瘤藥物，可抑制RNA 和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，研究表明單獨或者聯(lián)合化療方案對惡性淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、成骨肉瘤、膀胱癌、肝癌等多種癌癥均已取得顯著的療效，但耐藥的產(chǎn)生，導致化療的失敗，而限制了阿霉素的應用〔22～25〕。PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路廣泛存在細胞中，參與細胞的生長、增殖及分化〔26，27〕。有研究表明PI3K/Akt信號通路在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，Akt是該通路的活性中心，其活性的升高可以抑制細胞的凋亡〔28，29〕。阿霉素和細胞 DNA 結(jié)合后，DNA 損傷信息激活了PI3K/Akt信號通路，導致細胞凋亡的抑制，因此高表達PI3K/Akt則引起細胞凋亡閾值的增高，導致升高細胞對阿霉素引起的凋亡的耐受性〔30〕。本實驗從體外和體內(nèi)兩方面考察了姜黃素對肝癌逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，提示姜黃素可以顯著的逆轉(zhuǎn)肝癌細胞對阿霉素的耐藥性，并增強阿霉素誘導的細胞凋亡。其耐藥機制可能是姜黃素抑制了PI3K/Akt蛋白的高表達，從而降低了阿霉素誘導的細胞凋亡閾值。由此，我們可以預見姜黃素有可能作為一種新的肝癌細胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑，具有較廣闊的應用前景。