曾尤超 姜 芮 劉 濤 范瑞明

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腦血管病科，貴州 遵義 563003)

缺血性腦卒中發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)位居前列〔1〕，主要發(fā)病機(jī)制為腦組織失血、缺血或者缺氧，導(dǎo)致腦細(xì)胞功能的減退及能量代謝能力發(fā)生損傷，乃至誘導(dǎo)腦細(xì)胞凋亡和壞死〔2〕。對(duì)缺血性腦損傷的治療一直是人類生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)〔3,4〕。Escaletin(ESC)化學(xué)名為6，7-二羥基香豆素，俗稱“七葉亭”，通用名：秦皮乙素，是從植物中提取分離出來的一種化合物，是秦皮的主要有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡及利尿、平喘等作用〔5,6〕，其相關(guān)衍生物(如華法林)還具有抗血小板聚集的療效，目前華法林已廣泛應(yīng)用于臨床缺血性腦卒中的抗凝治療〔7～9〕，但關(guān)于ESC對(duì)減少缺血性腦損傷的報(bào)道還較少。本研究探討ESC對(duì)缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠85只，雌雄不拘，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2009-0007，平均體重為(302.5±25.7)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，均為SPF級(jí)別，飼養(yǎng)在遵義醫(yī)學(xué)院。

1.2動(dòng)物模型的構(gòu)建 采用10%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，清除頸部毛發(fā)后，利用乙醇進(jìn)行消毒；取大鼠頸中位置切口，使用動(dòng)脈夾夾頸總動(dòng)脈，鈍性分離其右側(cè)總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，于頸外動(dòng)脈游離端剪開約5 mm小口，并在小口下系一松結(jié)，從切口處插入制備好的線栓將頸外動(dòng)脈游離端向外上方拉伸，插入深度17～19 mm，阻塞大腦中動(dòng)脈導(dǎo)致腦缺血，然后再對(duì)入口處結(jié)扎。參考 Longa 等〔10〕對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，1～3分視為造模成功。

1.3動(dòng)物模型分組及ESC給藥處理 將構(gòu)建成功的大鼠模型均分為ESC處理組和模型組，同時(shí)選取等數(shù)量的SD大鼠作為陰性對(duì)照組，其中ESC處理組大鼠于腦缺血模型建立后給予ESC 5 mg·kg-1·d-1灌胃，ESC混懸液濃度為2.5 mg/ml；而模型組給予生理鹽水5 mg·kg-1·d-1灌胃，所有實(shí)驗(yàn)大鼠給藥1次。

1.4腦組織2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色 斷頭取腦，去除嗅腦、腦干、小腦，然后每隔2.5 mm距離切取冠狀組織片，一般切5～7片。然后將組織于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%～2.5%的TTC染液中進(jìn)行染色，在37℃孵育 20～40 min，顯色完全后進(jìn)行拍照。用圖像處理軟件(NIS-ElementsBR)分析圖像，計(jì)算出梗死面積百分比。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè) 通過ELISA檢測(cè)腦組織Toll樣受體(TLR)4、核因子(NF)-κB及膠質(zhì)細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子(GDNF)的表達(dá)情況，具體操作步驟及方法嚴(yán)格按試劑盒生產(chǎn)廠家所提供的說明書進(jìn)行。

1.6超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性測(cè)定 用含0.5%胰酶、0.05%乙二胺四乙酸(EDTA)的消化液消化細(xì)胞，收集好細(xì)胞后加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液在冰上進(jìn)行裂解細(xì)胞，裂解好細(xì)胞后，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量；采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定梗死腦組織SOD活性，應(yīng)用硫代巴比妥酸法測(cè)定腦組織及血清MDA含量〔11〕；測(cè)定操作步驟及方法嚴(yán)格按試劑盒(南京建成科技有限公司)說明書進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠模型構(gòu)建結(jié)果 在大鼠建模過程中，1只大鼠死亡，對(duì)剩下的84只模型大鼠進(jìn)行評(píng)分，共有76只(89.41%)造模成功。將76只大鼠模型隨機(jī)均分為ESC處理組和模型組，其中ESC處理組大鼠平均體重(297.2±17.3)g，雄性29只，平均周齡(4.4±1.4)w，神經(jīng)功能評(píng)分為(2.37±0.25)分。模型組大鼠平均體重為(306.8±18.2)g，雄性26只，平均周齡為(4.2±1.3)w，陰性對(duì)照組體重(302.7±19.1)g，雄性24只，周齡(4.3±1.4)w，神經(jīng)功能評(píng)分(0.37±0.09)分。各組周齡、體重、性別相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2ESC對(duì)缺血再灌注損傷后大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響 陰性對(duì)照組無顯著腦梗死出現(xiàn)，模型組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重梗死面積，而ESC處理組大鼠雖然出現(xiàn)了部分腦梗死，但是其腦梗死面積明顯小于模型組(P<0.05)，見圖1，且神經(jīng)功能評(píng)分〔(1.52±0.17)分〕相比于模型組〔(2.23±0.26)分〕也顯著降低(P<0.05)。

圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色結(jié)果

2.3ESC對(duì)缺血再灌注損傷后大鼠腦組織TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 與陰性對(duì)照組比較，模型組TLR4表達(dá)顯著提高，NF-κB的表達(dá)也顯著增強(qiáng)(P<0.05)；在進(jìn)行ESC藥物處理后，能夠顯著降低TLR4與NF-κB表達(dá)水平(P<0.05)。見表1。

表1 各組腦組織TLR4與NF-κB表達(dá)

與陰性對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.4ESC對(duì)缺血再灌注損傷后大鼠腦組織GDNF表達(dá)的影響 經(jīng)ESC藥物處理后，模型組大鼠腦組織中GDNF的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。見表2。

2.5ESC對(duì)缺血再灌注損傷后大鼠腦組織中MDA，SOD的影響 與模型組比較，ESC處理后，大鼠SOD酶活性顯著升高；而MDA的酶活性顯著降低(P<0.05)。見表3。

表2 各組大鼠腦組織GDNF表達(dá)

與模型組比較：1)P<0.05，下表同

表3 各組大鼠腦組織SOD與MDA酶活性

3 討 論

腦血管疾病在我國(guó)居民疾病死亡原因中已位居第一位，是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一〔12〕。存活者中大約60%的患者遺留癱瘓、失語等嚴(yán)重生理缺陷〔13〕。缺血性腦卒中是腦血管疾病中的最常見者，其一旦發(fā)生，致殘率較高，給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)〔14〕。

Cao等〔15〕在TLR4缺失的大鼠腦缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子(TNF)-α，白細(xì)胞介素(IL)-1β等炎性因子表達(dá)減少，說明TLR4與腦缺血再灌注的炎性反應(yīng)有關(guān)。并且研究發(fā)現(xiàn)，諸多器官，如肝臟，心臟的缺血再灌注與TLR4的表達(dá)密切關(guān)系〔16，17〕。本研究顯示，缺血再灌注大鼠。在用ESC處理后，TLR4與NF-κB的表達(dá)都能被顯著降低，說明ESC對(duì)腦缺血再灌注損傷的緩解，是通過TLR4/NF-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮抗炎作用，以減輕腦損傷。

SOD是一種抗氧化酶，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，提高SOD的表達(dá)，可以加強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能〔18〕。MDA是自由基氧化損傷后脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，會(huì)對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)的合成造成不良影響，它的升高代表機(jī)體損傷嚴(yán)重〔19〕。本研究結(jié)果顯示，ESC處理后，缺血再灌注損傷大鼠SOD酶活性顯著升高，MDA酶活性顯著降低。且ESC處理能夠顯著提高GDNF的表達(dá)，發(fā)揮多效能的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。