張文昶 李遠冠 黃 深 何 川

(北京航天中心醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100049)

心肌梗死發(fā)病率、致殘率和致死率均較高，心肌細胞缺血缺氧是心肌梗死過程中引起細胞發(fā)生不可逆轉凋亡或死亡的主要原因，并可導致心功能不全〔1，2〕。細胞凋亡所引起的心肌細胞丟失在心肌梗死引起的心力衰竭中具有重要作用〔3〕。研究發(fā)現(xiàn)，生長因子、皮質(zhì)激素、轉化生長因子(TGF)-β、黃體生成素等多種因子均能誘導補體應答基因(RGC)32的表達，在腫瘤轉移、增殖分化、炎癥反應等過程中有關鍵作用，從而影響人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展〔4，5〕。作為TGF-β1信號通路下游基因，過表達RGC32的人近端腎小管上皮細胞無TGF-β1刺激即可發(fā)生上皮細胞-間質(zhì)轉化(EMT)，而敲除RGC32的細胞中有TGF-β1刺激也不能發(fā)生EMT〔6〕，此外，有研究發(fā)現(xiàn)在纖維結締組織形成過程中出現(xiàn)RGC32的表達上調(diào)〔7〕。但RGC32對心肌梗死心肌細胞的影響及機制尚未清楚。本研究旨在探討RGC32基因對心肌梗死心肌細胞凋亡及免疫機制的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 12周齡C57BL/6雄性小鼠，25～30 g，用于心肌梗死模型的制備；SPF級出生1～3 d的SD大鼠乳鼠用于原代心肌細胞的獲得，實驗動物均購自中國醫(yī)學科學院，均得到動物委員會批準。

1.2主要試劑和儀器 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒和電化學發(fā)光(ECL)試劑盒購自美國Piece；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；Bcl-2相關X蛋白(Bax)、 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3、Notch1、Hes1抗體均購自美國abcam公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3RGC32基因在心肌梗死心肌組織的表達 參照石洪濤等〔8〕的方法建模，小鼠經(jīng)水合氯醛(3.3%)麻醉固定后，開胸結扎小鼠冠狀動脈前降支，建立心肌梗死模型，心電圖ST段檢測發(fā)現(xiàn)有明顯提高，且心尖部變白為模型建立成功。取心肌組織，提取組織中的總蛋白，BCA法對蛋白進行定量，取30 μg蛋白樣品行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離，轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉后加入一抗，RGC32及內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)均按照1∶1 000稀釋，4℃過夜孵育后洗膜，加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，洗膜，增強型ECL顯影。

1.4心肌細胞轉染及缺血缺氧模型的制備 無菌條件下剔出大鼠的心臟，除去大血管、心房等一些結締組織，加入已經(jīng)配置好的胰酶對心肌細胞進行消化。消化完全后收集組織消化懸液，離心，棄掉上清，含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，按照密度5×104/cm2接種細胞于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，細胞處于生長對數(shù)期后按照ABI公司的轉染方法轉染RGC32的siRNA于心肌細胞，轉染12 h后，將培養(yǎng)液換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿放置于培養(yǎng)罐內(nèi)，并在缺氧罐中放Genbox厭氧產(chǎn)氣包，制造成缺血缺氧模型，最后放置培養(yǎng)罐于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，缺血缺氧處理48 h后收集細胞用于實驗研究。實驗分為正常對照組、陰性對照組(轉染不具有干擾作用的siRNA并進行缺血缺氧處理)、缺血缺氧組、缺血缺氧+RGC32-siRNA組(轉染干擾RGC32表達的siRNA并進行缺血缺氧處理)。

1.5TUNEL法檢測各組細胞凋亡 各組細胞凋亡參照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒的操作說明。

1.6各組白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達檢測 通過RT-PCR檢測各組細胞中炎癥因子IL-6和TNF-α表達。通過Trizol法提取細胞中的總RNA，根據(jù)逆轉錄試劑盒操作反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，20 μl反應體系，實時熒光定量PCR儀進行擴增，所有引物由上海生工合成。采用2-△△Ct比較法根據(jù)Ct均值對RGC32的mRNA相對含量進行定量。

1.7各組細胞RGC32、Caspase3、Bax、Notch1、Hes1蛋白表達檢測 各組細胞中RGC32、Caspase3、Bax、Notch1、Hes1蛋白的表達參照1.3方法。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1心肌梗死小鼠心肌組織RGC32的表達 RGC32在心肌梗死心肌組織中的表達(0.668±0.053)顯著高于正常心肌組織(0.112±0.015，t=17.484，P=0.000)。

2.2RGC32在心肌細胞表達 陰性對照組(0.689±0.075)與缺血缺氧組RGC32(0.712±0.079)差異無統(tǒng)計學意義(t=0.466，P=0.654)，缺血缺氧組顯著高于正常對照組(0.105±0.012)和缺血缺氧+RGC32-siRNA組(t=12.301，5.411；P=0.000，0.001)。

2.3RGC32對心肌細胞凋亡的影響 陰性對照組(27.16%±1.88%)和缺血缺氧組心肌細胞凋亡率(28.39%±2.03%)差異無統(tǒng)計學意義(t=0.975，P=0.358)，缺血缺氧組顯著高于正常對照組(2.48%±0.56%)和缺血缺氧+RGC32-siRNA組(15.65%±1.26%；t=20.530，10.095，均P=0.000)。

2.4RGC32對心肌細胞IL-6和TNF-α表達的影響 陰性對照組和缺血缺氧組IL-6和TNF-α表達差異無統(tǒng)計學意義(t=0.673，0.695，P=0.520，0.507)，缺血缺氧組均顯著高于正常對照組(t=9.213，24.031，均P=0.000)和缺血缺氧+RGC32-siRNA組(t=4.726，7.992，P=0.002，0.000)。見表1。

表1 RGC32對心肌細胞IL-6和TNF-α表達的影響

與缺血缺氧組比較：1)P<0.05；下表同

2.5RGC32對心肌細胞Caspase3、Bax、Notch1、Hes1表達的影響 陰性對照組和缺血缺氧組Caspase3、Bax、Notch1、Hes1表達差異無統(tǒng)計學意義(t=0.312，0.579，0.406，0.380，P=0.763，0.579，0.695，0.714)，缺血缺氧組Caspase3和Bax表達均顯著高于正常對照組(t=9.505，8.356，均P=0.000)和缺血缺氧+RGC32-siRNA組(t=4.683，3.321，P=0.002，0.011)，Notch1和Hes1表達顯著低于正常對照組(t=12.158，9.787，均P=0.000)和缺血缺氧+RGC32-siRNA組(t=8.288，4.961，P=0.000，0.001)。見表2。

表2 RGC32對心肌細胞Caspase3、Bax、Notch1、Hes1蛋白表達的影響

3 討 論

目前，心肌梗死已成為我國疾病引起死亡的原因之一，心肌細胞缺血缺氧引起的心肌細胞凋亡是導致心肌梗死后心力衰竭、心功能不全的一個關鍵因素〔9〕。RGC32在細胞的增殖、分化、再生及炎癥反應中均發(fā)揮重要作用，在多種疾病中也備受關注〔10〕。有研究發(fā)現(xiàn)，在充血性心力衰竭患者進行左心室輔助支持裝置植入，心肌結構發(fā)生重塑過程中RGC32表達升高，在小鼠心肌肥厚實驗模型中也發(fā)現(xiàn)RGC32的表達升高〔11，12〕。

本研究結果發(fā)現(xiàn)缺血缺氧可引起心肌細胞凋亡，而抑制RGC32表達可減輕這一效應。細胞凋亡是細胞的一種程序性死亡方式，一方面可維持機體的正常生長發(fā)育，也參與多種疾病的發(fā)生。細胞凋亡過程中Caspase家族和Bcl-2家族起到關鍵作用，Caspase3是Caspase家族的關鍵酶，處在其級聯(lián)反應下游，活化的Caspase3可使凋亡進入不可逆階段〔13，14〕。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死中Caspase3被激活〔15〕。Bax是Bcl-2家族的促凋亡蛋白，活化的Bax可誘導線粒體釋放細胞色素C，從而誘導細胞的凋亡〔16〕。本研究結果提示RGC32可通過下調(diào)Caspase3和Bax表達降低心肌梗死心肌細胞的凋亡。

心肌梗死后心功能不良及心室重構的一個關鍵因素是炎癥損傷，心肌缺血缺氧而導致的無菌性炎癥反應，可引起免疫細胞的聚集與活化，釋放IL-6、TNF-α等一些炎癥因子〔17，18〕。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6和TNF-α表達水平與慢性心力衰竭進展有密切關系，可導致左心室擴大和壁變薄、心室收縮功能減退〔19〕。Notch1信號通路是一條在進化上高度保守的信號轉導途徑，其家族成員對細胞的發(fā)育、凋亡、分化等過程有重要作用〔20〕。研究發(fā)現(xiàn)，激活Notch1信號通路可保護心肌細胞的缺氧復氧損傷，可加快心肌梗死后心功能的恢復〔21〕。Hes1基因是Notch1信號通路下游重要的效應分子，是其是否激活的標志。本研究發(fā)現(xiàn)RGC32可提高由缺血缺氧引起Notch1和Hes1表達的降低。

綜上，RGC32基因在心肌梗死心肌組織表達升高，抑制心肌細胞RGC32基因表達可降低細胞凋亡、提高免疫及激活Notch1信號通路，其中對心肌細胞凋亡的影響是下調(diào)Caspase3和Bax表達，提示RGC32可能是心肌梗死新的治療靶點。