趙桂峰 黃欣瑋 毛靜遠(yuǎn) 吳麗玉

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管科，天津 300193)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)指缺血心肌組織在血液重新灌流后，出現(xiàn)細(xì)胞代謝功能障礙或結(jié)構(gòu)破壞反而加重的現(xiàn)象。炎癥反應(yīng)是MIRI重要機(jī)制之一。再灌注后中性粒細(xì)胞(PMNs)浸潤、聚集，釋放細(xì)胞炎癥因子、氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。參芍膠囊由人參莖葉皂甙和白芍制成的中成藥制劑，是治療冠心病的國家中藥保護(hù)品種。本研究探討參藥膠囊及有效成分對MIRI大鼠PMNs浸潤和炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康的雄性Wistar大鼠，體重250～300 g，SPF級(jí)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001〕。所有大鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，具有良好通風(fēng)和空氣過濾系統(tǒng)，將大鼠按體重編號(hào)后，室溫20～25℃，相對濕度40%～60%，給予普通大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，日照采用日光燈12 h開關(guān)循環(huán)進(jìn)行，觀察3 d后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑與儀器 參芍膠囊(SS)(由人參莖葉皂甙和白芍組成，保定天浩制藥有限公司提供，批號(hào)150701)，人參莖葉總皂苷(TSFG)、白芍浸膏粉(Pae)(保定天浩制藥有限公司提供)，阿托伐他汀(Ator)鈣片(輝瑞制藥有限公司提供，批號(hào)L14582，規(guī)格20 mg)，腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-10試劑盒(美國Uscn Life science Inc 公司，批號(hào)分別為SEA133Ra，SEA563Ra,SEA056Ra)，Spectra Max190型酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

1.3動(dòng)物模型制備與評價(jià) 各組大鼠于術(shù)前禁食12 h，自由飲水，記錄體重，用5%水合氯醛(6 ml/kg)腹腔注射麻醉。2～5 min后，仰臥位固定，消毒左側(cè)胸前及腋下皮膚，胸部備皮。記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。沿左側(cè)第3、4肋間(或心臟搏動(dòng)最明顯處)剪開左胸皮膚約1 cm，用止血鉗逐層分離皮下組織。在心臟搏動(dòng)最明顯處用彎止血鉗撐開胸廓，將心臟擠出胸腔，持5/0無創(chuàng)縫合針絲線，于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間，在離左冠狀動(dòng)脈前降支起始部約2 mm處進(jìn)針，深度大約1 mm，在結(jié)扎處預(yù)先墊一根1/0粗棉線，而后把冠狀動(dòng)脈及棉線一起進(jìn)行結(jié)扎，第二結(jié)為滑結(jié)，隨后立即把心臟送回胸腔并排氣凈血，再用直頭止血鉗夾閉皮膚及肌肉層，造成心肌缺血。心電圖示ST段抬高并與T波融合，結(jié)扎線下心肌組織發(fā)紺，說明心肌缺血模型成功。30 min后，松開止血鉗，恢復(fù)血流灌注，出現(xiàn)再灌注心律失常，標(biāo)志再灌注成功。見圖1。其中假手術(shù)組在左冠狀動(dòng)脈前降支下只穿線不進(jìn)行結(jié)扎。

圖1 大鼠造模不同時(shí)間點(diǎn)心電圖變化

1.4分組與給藥 將70只Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血再灌注(I/R)組，SS 250 mg/kg(SS250)組，SS 500 mg/kg(SS500)組，TSFG組，Pae組和Ator組共7組，每組10只。SS組劑量依據(jù)人與大鼠體表面積換算，用0.9%生理鹽水配制成濃度分別為25 mg/ml和50 mg/ml溶液。每1 000粒SS(0.25 g/粒)中含TSFG 13 g，Pae 185 g。SS 500 mg/kg對應(yīng)TSFG溶液濃度為2.6 mg/ml，Pae溶液濃度為37 mg/ml。Ator組溶液濃度為1 mg/ml。假手術(shù)組和I/R組予等量生理鹽水。預(yù)灌胃1 w，每天上午給藥1次，自由飲食飲水。術(shù)前1 h末次給藥。

1.5中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 將心臟取結(jié)扎線下1～2 mm部位，橫切2～3 mm厚度的組織固定，常規(guī)脫水，包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片后，每組大鼠各取一張切片，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野，每組共計(jì)觀察6個(gè)視野，計(jì)算PMNs數(shù)量，然后取其均值。

1.6酶聯(lián)免疫吸附法檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-10 左室插管結(jié)束后進(jìn)行大鼠腹主動(dòng)脈取血6 ml，置于37℃水浴2 h，之后3 000 r/min，15 min進(jìn)行離心，取上清，分裝后-80℃保存。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。酶標(biāo)儀在450 nm波長測光密度。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，OD值均值為橫坐標(biāo)作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品濃度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1心肌組織病理學(xué)形態(tài)變化 假手術(shù)組可見左室外膜局部區(qū)域心肌細(xì)胞輕度水腫，少量炎細(xì)胞浸潤；I/R組可見左室大部分區(qū)域心肌細(xì)胞重度水腫及大量的炎細(xì)胞浸潤，外膜局部區(qū)域可見灶性壞死；SS250組和Pae組左室大部分區(qū)域(1/2以上)中度水腫，炎細(xì)胞浸潤，外膜區(qū)域可見散在的灶性壞死；TSFG組左室部分區(qū)域可見輕到中度的心肌細(xì)胞水腫，炎細(xì)胞中度浸潤；SS500組及Ator組左室心肌細(xì)胞水腫程度有所減輕，可見炎細(xì)胞浸潤，無灶性壞死。見圖2。

(黑色箭頭:炎細(xì)胞浸潤；白色箭頭:細(xì)胞水腫)圖2 各組心肌HE染色(×400)

2.2中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 與假手術(shù)組〔(18.53±0.84)個(gè)/視野〕比較，各組MIRI大鼠心肌組織中PMNs數(shù)量顯著升高〔I/R組(33.44±1.22)個(gè)/視野、SS250組(18.78±0.84)個(gè)/視野、SS500組(19.50±0.69)個(gè)/視野、TSFG組(22.33±1.29)個(gè)/視野、Pae組(29.33±0.82)個(gè)/視野、Ator組(28.60±1.01)個(gè)/視野，P<0.01〕。與I/R組比較：用藥各組PMNs數(shù)量顯著減少(P<0.05，P<0.01)。與Pae及Ator比較：SS250組、SS500組和TSFG組PMNs數(shù)量顯著減少(P<0.01)。與TSFG組比較，SS250、SS2500組PMNs數(shù)量顯著減少(P<0.05)。

2.3各組血清中炎癥因子的變化 與假手術(shù)組比較，I/R組TNF-α濃度顯著升高(P<0.01)。與I/R組比較，SS250組、SS500組、TSFG組TNF-α濃度明顯降低(P<0.01，P<0.05)。與假手術(shù)組比較，I/R組IL-1β濃度明顯升高(P<0.05)。與I/R組比較，SS250 組、SS500組、Pae組和Ator組IL-1β濃度明顯降低(P<0.05)；TSFG組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。用藥組之間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，I/R組IL-10濃度顯著下降(P<0.01)。與I/R組比較，SS250組、SS500組IL-10濃度明顯升高(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較

與假手術(shù)組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與I/R組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

炎癥反應(yīng)是介導(dǎo)MIRI的重要機(jī)制之一。PMNs在炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。MIRI過程中PMNs被激活并黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞水腫和功能障礙，毛細(xì)血管腔堵塞，發(fā)生無復(fù)流現(xiàn)象。其中活化的PMNs可誘發(fā)細(xì)胞膜磷脂A2釋放大量花生四烯酸，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)〔1〕。其中TNF-α是啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵因素。主要作用有抑制心肌收縮力；誘導(dǎo)多種炎癥因子和黏附分子的產(chǎn)生；誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。抑制TNF-α的表達(dá)可以減輕MIRI程度。IL-1β是單核巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子，廣泛參與機(jī)體缺血缺氧、炎癥、應(yīng)激的調(diào)控。其參與MIRI的過程主要作用有介導(dǎo)PMNs與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子的表達(dá)，促進(jìn)PMNs的遷移及浸潤，加劇炎癥反應(yīng)及微血管阻塞；同時(shí)與TNF-α具有協(xié)同作用，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生心肌毒性作用。所以TNF-α和IL-1β是MIRI發(fā)生時(shí)兩種最重要的促炎因子〔2〕。而細(xì)胞因子IL-10是由各種淋巴細(xì)胞產(chǎn)生炎癥抑制因子。抑制促炎因子的過度表達(dá)，在下調(diào)炎癥反應(yīng)，減輕心肌損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。雖然炎癥反應(yīng)在MIRI過程中會(huì)對心臟產(chǎn)生不利的影響。但應(yīng)用糖皮質(zhì)激素抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)則不利于心臟組織修復(fù)和功能恢復(fù)。所以，炎癥是把“雙刃劍”。如何利用中醫(yī)藥的“多靶點(diǎn)，多環(huán)節(jié)”的優(yōu)勢進(jìn)行干預(yù)，雙向調(diào)節(jié)，趨利避害，才是中醫(yī)藥防治MIRI的研究重點(diǎn)。目前中醫(yī)藥復(fù)方、有效組分等的研究已經(jīng)顯示了良好的基礎(chǔ)和臨床效果〔3〕。

SS組方精簡，以人參為君藥，益氣養(yǎng)陰；《本經(jīng)》云：“主補(bǔ)五臟，安精神，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智?！薄端幮哉摗吩疲骸爸魑迮K氣不足，五勞七傷，虛損瘦弱……補(bǔ)五臟六腑，保中守神。”白芍為臣藥，行瘀止痛，養(yǎng)血和陰?！侗窘?jīng)》云：味苦，平，主治邪氣腹痛，除血痹，破堅(jiān)積……利小便，益氣。兩藥合用,共奏益氣活血，化瘀止痛之功效。

本研究中發(fā)現(xiàn)，SS及其成分均能夠抑制PMNs的浸潤。雖然兩種劑量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但高劑量組顯示更好的作用趨勢。其中，TSFG作用好于Pae，體現(xiàn)方劑中君藥的核心作用。其次，SS具有抑制促炎因子TNF-α、IL-1β，提高抗炎因子IL-10生成的作用，且無劑量依賴性。而Pae和TSFG分別對TNF-α及IL-1β無明顯抑制作用。揭示SS兩種成分分別作用于不同的炎癥因子產(chǎn)生抗感染作用。體現(xiàn)了中醫(yī)藥的多靶點(diǎn)協(xié)同整合作用的優(yōu)勢。再次，SS復(fù)方具有促進(jìn)抗炎因子IL-10產(chǎn)生的作用，而其單一組分卻無明顯作用。進(jìn)一步揭示SS兩種成分的協(xié)同作用，整體作用是多種成分微作用的整合，是“合力”。但多靶點(diǎn)作用并不是簡單地成分堆積。只有在中醫(yī)理論指導(dǎo)下的方劑配伍才能成為有機(jī)的多靶點(diǎn)組合。有效組分的作用機(jī)制研究也是中醫(yī)配伍理論科學(xué)內(nèi)涵的研究重點(diǎn)之一。對于該藥的研究必須針對MIRI發(fā)生不同階段的病理生理機(jī)制，進(jìn)一步深入研究其有效組分和干預(yù)機(jī)制。