張保龍 馬利閣 尹萬(wàn)樂(lè) 李 達(dá) 宗淑君 王 芳 段小珍 尤笑迎

(鄭州人民醫(yī)院骨三科，河南 鄭州 450000)

骨肉瘤是一種多發(fā)于青少年或兒童的惡性骨腫瘤，發(fā)病率高，易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)〔1，2〕。目前常用的治療方法是手術(shù)、化療、放療等，但預(yù)后較差，其主要原因是出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)〔3，4〕。骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、遷移受多種轉(zhuǎn)移基因的影響，但其轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不完全清楚。研究表明，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2在骨肉瘤組織中的表達(dá)量高于正常組織，對(duì)骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展起重要作用〔5〕。本實(shí)驗(yàn)擬分析下調(diào)Bcl-2基因?qū)侨饬黾?xì)胞侵襲、遷移能力的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器 人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，胰蛋白酶、Matrigel基質(zhì)膠、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海Solarbio公司，RIPA裂解液購(gòu)自南京碧云天生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)板、Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Costar公司，Bcl-2抗體、β-連環(huán)蛋白(catenin)抗體、c-Myc抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Cell signaling公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，凝膠成像儀購(gòu)自上海天能凝膠成像系統(tǒng)公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將MG-63凍存管取出，在37℃水浴鍋中溶化30 s，加入5 ml DMEM培養(yǎng)基，離心，收集細(xì)胞至培養(yǎng)瓶中，在5% CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%左右，加入胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代，每隔2 d傳代1次。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，消化、離心，加入不含抗生素的DMEM培養(yǎng)基，每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右開(kāi)始轉(zhuǎn)染。將500 μl Opti-MEM培養(yǎng)基和2 ml siRNA-NC(50 nmol/L)或siRNA-Bcl-2(50 nmol/L)混勻，加入LipofectamineTM2000，室溫靜置20 min，將混合液加入6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，更換完全培養(yǎng)基，48 h后進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白組、MG-63 NC組(轉(zhuǎn)染siRNA-NC)和MG-63-siRNA組(轉(zhuǎn)染siRNA-Bcl-2)，Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.4Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，200 μl不含血清的培養(yǎng)基和1×104個(gè)細(xì)胞接種到Transwell小室中，將小室置于24孔板中，加入500 μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)基于24孔板中，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗小室，棉簽輕輕拭去小室中的細(xì)胞，1%甲醇固定小室細(xì)胞10 min，蘇木精染色5 min，在倒置顯微鏡下觀察穿過(guò)濾膜表面的細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔，選取5個(gè)視野，取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel基質(zhì)膠融化為液體，以1∶9的比例加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠，加入50 μl稀釋好的Matrigel膠包被Transwell小室底部，37℃通風(fēng)3 h，細(xì)胞提前使用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，0.25%胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，將1×104個(gè)細(xì)胞接種到Matrigel膠包被的Transwell小室中，24孔板中加入500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棉簽擦去小室中的細(xì)胞，使用1%甲醇固定10 min，蘇木精浸泡5 min，取5個(gè)視野，觀察細(xì)胞的數(shù)量，每組5個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.6Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)水平 胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，加入200 μl預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，在冰上放置15 min，離心，取上清，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。取50 μg蛋白上樣緩沖液混合均勻，置于沸水中變性5 min。將10%的分離膠加入凝膠玻璃板中間，配置6%的濃縮膠，加入樣品蛋白，80 V電泳至樣品進(jìn)入濃縮膠，調(diào)整電壓至100 V，待溴酚藍(lán)遷移至分離膠底部，停止電泳。切下目的蛋白條帶，加入電泳緩沖液，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜上。將轉(zhuǎn)膜后獲得的BC膜置于10 ml 5%脫脂牛奶封閉1 h。加入1%脫脂牛奶稀釋的一抗，4℃過(guò)夜。Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗3～4次，每次5～10 min，加入適量稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃結(jié)合2 h，TBST洗膜3～4次，每次5～10 min。暗室中與顯影液反應(yīng)1 min，定影10～15 min，清水沖洗晾干，以β-actin為對(duì)照，凝膠成像儀分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1siRNA-Bcl-2轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá) Western印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MG-63-siRNA組Bcl-2蛋白表達(dá)量(0.352±0.066)明顯低于空白組(0.684±0.074，P<0.05)，而MG-63 NC組(0.701±0.083)和空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 siRNA-Bcl-2轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)

2.2干預(yù)Bcl-2基因表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移能力的影響 MG-63-siRNA組穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)〔(43.852±3.752)個(gè)〕較空白組〔(82.489±6.522)個(gè)〕顯著降低(P<0.05)，而MG-63 NC組〔(85.487±4.123)個(gè)〕與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3干預(yù)Bcl-2基因表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的影響 MG-63-siRNA組細(xì)胞的侵襲數(shù)目〔(13.225±1.658)個(gè)〕較空白組〔(45.685±2.289)個(gè)〕顯著降低(P<0.05)，而MG-63 NC組〔(42.587±3.145)個(gè)〕與空白組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4干預(yù)Bcl-2基因表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中β-catenin、c-Myc蛋白水平的影響 與空白組相比，MG-63 NC組β-catenin、c-Myc蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MG-63-siRNA組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖2。

圖2 干預(yù)Bcl-2基因表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中β-catenin、c-Myc蛋白水平的影響

組別β-catenin/β-actinc-Myc/β-actin空白組1.202±0.3641.252±0.326MG-63 NC組1.336±0.2981.120±0.341MG-63-siRNA組0.574±0.0851)0.462±0.0781)

與空白組比較：1)P<0.05

3 討 論

骨肉瘤是一種發(fā)病率高、致殘率高的惡性腫瘤，由于具有較高的侵襲和遷移能力，患者預(yù)后較差〔6〕。常見(jiàn)的骨肉瘤治療方式是手術(shù)結(jié)合放化療，但治療效果并不滿意，主要原因是骨肉瘤存在早期轉(zhuǎn)移，多見(jiàn)于肺部轉(zhuǎn)移〔7，8〕。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，由多種細(xì)胞、促轉(zhuǎn)移基因、抑制轉(zhuǎn)移基因共同參與〔9，10〕。促轉(zhuǎn)移基因主要促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力，抑制轉(zhuǎn)移基因主要抑制腫瘤細(xì)胞的的侵襲、遷移能力。機(jī)體在正常生理狀態(tài)下，促轉(zhuǎn)移基因和抑制轉(zhuǎn)移基因處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但當(dāng)機(jī)體發(fā)生病理性變化時(shí)，促轉(zhuǎn)移基因和抑制轉(zhuǎn)移基因的動(dòng)態(tài)平衡處于紊亂狀態(tài)，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力。既往研究表明，Bcl-2能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡能力影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA Bcl-2后，細(xì)胞中Bcl-2的水平明顯下調(diào)，而且Bcl-2表達(dá)量下降的MG-63細(xì)胞的侵襲、遷移能力顯著降低。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一種高度保守的Wnt經(jīng)典通路，調(diào)控細(xì)胞的各種生命活動(dòng)〔12〕。在胚胎發(fā)育中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞及重要器官的生長(zhǎng)、分化；在成熟個(gè)體中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等過(guò)程〔13〕。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路中重要因子，其表達(dá)量水平影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性。當(dāng)β-catenin表達(dá)量降低時(shí)，Wnt信號(hào)通路處于未激活狀態(tài)；當(dāng)β-catenin水平累積增高，可促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核中，激活Wnt信號(hào)通路，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)〔14〕。研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，其通路的異?；罨纱龠M(jìn)下游靶基因c-Myc、細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1等的表達(dá)，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、侵襲、遷移〔15，16〕。本研究結(jié)果提示干預(yù)Bcl-2可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其下游靶基因c-Myc表達(dá)降低MG-63骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力。