張 穎 李 潔 李 剛 李 濤 梁海翔

(天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300074)

老年抑郁癥是一組異質(zhì)性疾病，通常伴有認知功能障礙。腦卒中后抑郁占老年抑郁癥患者的30%～40%〔1〕，是引發(fā)抑郁癥的主要病理因素之一。持續(xù)的抑郁狀態(tài)可引發(fā)認知功能障礙，導(dǎo)致患者日常生活不能自理，給家庭和社會帶來沉重負擔(dān)。海馬組織是邊緣系統(tǒng)的重要組成，也是學(xué)習(xí)、情感等高級認知的重要解剖學(xué)基礎(chǔ)〔2〕。動物實驗顯示，孤氧并行為限制的大鼠海馬組織中芳香烴受體核轉(zhuǎn)移蛋白(Arnt)2表達明顯上調(diào)、神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白(Npas)4表達明顯下調(diào)〔3〕，提示Arnt2和Npas4可能通過改變海馬功能進而對認知功能產(chǎn)生影響。本研究分析Arnt2、Npas4對老年抑郁癥患者認知功能的影響機制。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2015年6月至2016年10月天津市安定醫(yī)院老年科、神經(jīng)內(nèi)科、精神科住院的老年患者共173例。篩選標(biāo)準(zhǔn)：①既往無心肺衰竭、癌癥等嚴重疾病；②既往無精神類疾病史，神志清晰，能夠配合本次研究；③經(jīng)患者本人或其家屬知情同意。使用漢密爾頓抑郁量表(HAMD)-24評定患者精神情況：≤20分為無抑郁，21～35分為抑郁，>35分為嚴重抑郁。本研究依據(jù)HAMD-24量表評分結(jié)合患者腦卒中病史進行分組：有腦卒中病史且評分>20分為腦卒中后抑郁組(47例)；無腦卒中病史且評分>20分為原發(fā)性抑郁組(52例)；有腦卒中病史且評分≤20分為腦卒中組(45例)；無腦卒中病史且評分≤20分為對照組(29例)。

1.2主要試劑 Trizol試劑盒、TIAN Script cDNA合成試劑盒購于上海索寶生物科技有限公司；RIPA裂解液購于無錫柏歐美地生物科技有限公司；鼠抗人Arnt2單抗隆抗體、兔抗人Npas4單抗隆抗體、GAPDH抗體購于上海康朗生物科技有限公司。

1.3研究方法

1.3.1認知功能評價 腦卒中后抑郁組、原發(fā)性抑郁組、腦卒中組患者分別于入院1 w內(nèi)和2 w后進行認知功能評價。使用日本光電MEB-9200K肌電圖誘發(fā)電位儀測定，具體方法為：患者取臥位，放松全身肌肉，直視前方注意力集中，采用靶刺激和非靶刺激。其中非靶刺激規(guī)律出現(xiàn)，靶刺激隨機出現(xiàn)，患者對靶刺激進行按鍵反應(yīng)，設(shè)備記錄命中率及反應(yīng)時間，重復(fù)3次取均值。以對照組為參照，觀察P300的波幅及潛伏期，異常標(biāo)準(zhǔn)為超出對照組2.5個標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.2標(biāo)本采集與處理 入選患者分別抽取空腹外周靜脈血5 ml，抗凝處理后2 000 r/min離心20 min，最上層為血漿，中間層為白細胞，下層為紅細胞。使用無菌吸管分離血漿層和白細胞層并分裝到不同離心管中，血漿放于-80℃凍存，白細胞用于提取RNA檢測mRNA和蛋白表達情況。

1.3.3熒光定量PCR檢測Arnt2、Npas4 mRNA表達情況 Trizol試劑盒提取白細胞中的總RNA，紫外分光光度法檢測濃度并計算含量，取其中5 μg逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Arnt2、Npas4引物由北京創(chuàng)博環(huán)球生物科技有限公司設(shè)計并合成。反應(yīng)體系共20 μl：cDNA 2 μl、上游和下游引物各1 μl、Sybr熒光染料7 μl、雙蒸餾水9 μl。反應(yīng)條件：95℃ 5 min、95℃ 30 s、60℃ 10 s、72℃ 20 s，共40個循環(huán)。分析各條帶熒光強度，以Ct表示，以GAPDH為內(nèi)參計算相對表達量。

1.3.4Western印跡檢測Arnt2、Npas4蛋白表達情況 RIPA緩沖液提取白細胞中蛋白并測定濃度，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉2 h，室溫下分別滴加鼠抗人Arnt2單抗隆抗體(1∶1 000)、兔抗人Npas4單抗隆抗體(1∶500)，4℃孵育過夜；次日滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫下避光孵育2 h，曝光、顯影后用Image J分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算相對表達量。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組事件相關(guān)電位P300潛伏期及波幅 與對照組相比，入院1 w內(nèi)和2 w后的腦卒中后抑郁組、原發(fā)性抑郁組、腦卒中組患者P300潛伏期顯著延長，P300波幅顯著降低(P<0.05)；與原發(fā)抑郁組和腦卒中組相比，腦卒中后抑郁組P300潛伏期顯著延長，P300波幅顯著降低(P<0.05)；入院2 w后腦卒中后抑郁組、原發(fā)性抑郁組、腦卒中組較入院1 w內(nèi) P300潛伏期顯著縮短，P300波幅顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

2.2各組外周血Arnt2、Npas4 mRNA表達情況 腦卒中后抑郁組和原發(fā)性抑郁組Arnt2 mRNA相對表達量明顯高于腦卒中組和對照組，Npas4 mRNA相對表達量明顯低于腦卒中組和對照組(均P<0.05)；腦卒中后抑郁組Arnt2 mRNA和Npas4 mRNA相對表達量與原發(fā)性抑郁組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖2。

表1 各組入院1 w內(nèi)和2 w后 P300潛伏期、波幅比較

與對照組相比：1)P<0.05；與原發(fā)抑郁組相比：2)P<0.05；與腦卒中組相比：3)P<0.05；與入院1 w內(nèi)比較：4)P<0.05

圖1 各組事件相關(guān)電位P300波形

組別nArnt2 mRNANpas4 mRNA腦卒中后抑郁組471.85±0.151)2)0.87±0.111)2)原發(fā)性抑郁組521.41±0.241)2)0.82±0.231)2)腦卒中組451.03±0.321.31±0.44對照組290.86±0.101.24±0.47

與腦卒中組相比：1)P<0.05；與對照組相比：2)P<0.05

圖2 各組Arnt2、Npas4 mRNA擴增電泳圖

2.3各組外周血Arnt2、Npas4 蛋白表達情況 腦卒中后抑郁組和原發(fā)性抑郁組Arnt2 蛋白相對表達量分別為(5.91±1.13)、(5.57±0.96)，明顯高于腦卒中組和對照組(3.26±1.38)、(2.91±1.05)；Npas4 蛋白相對表達量分別為(2.51±0.84)、(2.40±0.93)，明顯低于腦卒中組和對照組(7.16±1.18)、(7.86±1.29)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；腦卒中后抑郁組Arnt2和Npas4蛋白表達與原發(fā)性抑郁組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見圖3。

圖3 各組外周血Arnt2、Npas4 蛋白電泳條帶

3 討 論

老年人群中抑郁癥患病率高達10%～20%〔4〕，目前認為老年抑郁癥的發(fā)生多由應(yīng)激事件或年齡相關(guān)大腦退行性病變誘發(fā)，導(dǎo)致長期下丘腦-腎上腺-皮質(zhì)醇功能失調(diào)，皮質(zhì)醇分泌量增加，長期作用于海馬中相應(yīng)受體引發(fā)海馬萎縮和功能喪失〔5〕。腦細胞屬于不可再生的永久性細胞，腦卒中可造成大腦神經(jīng)細胞損傷，易出現(xiàn)抑郁及認知功能障礙，其不但增加了家庭和社會負擔(dān)，還提升了患者死亡率〔6〕。事件相關(guān)電位中P300受外界物理因素影響程度較小，能夠較為客觀地反映受試者記憶、感知等大腦高級功能情況，因此本研究觀察患者P300波幅和潛伏期的變化〔7〕。研究結(jié)果提示腦卒中后抑郁和腦卒中后均會出現(xiàn)認知功能障礙，且腦卒中后抑郁患者認知功能損傷更為嚴重；腦卒中后抑郁患者與原發(fā)抑郁者相比，不僅存在精神運動障礙，還會減慢大腦對外界信息的處理速度，腦卒中對大腦組織的損傷也會加重認知功能傷害。

Arnt2屬于堿性螺旋轉(zhuǎn)錄因子超家族，在細胞周期、分化、應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)調(diào)控基因表達網(wǎng)絡(luò)中起重要調(diào)控作用〔8〕。Npas4與Arnt2屬于相同家族，在大腦發(fā)育、突觸生成和維護等方面發(fā)揮重要作用，是大腦重塑的關(guān)鍵因子〔9〕。動物實驗顯示，孤氧并行為限制的小鼠海馬體積較正常同齡小鼠降低7.2%，并伴有神經(jīng)受損，其中海馬中的Npas4表達明顯下調(diào)，Arnt2表達明顯上調(diào)〔10〕，提示Npas4表達下調(diào)和Arnt2下調(diào)可能應(yīng)激誘導(dǎo)海馬功能損傷。相關(guān)研究顯示，Arnt和Npas家族成員廣泛分布于人淋巴組織中，故本次研究通過外周血分離白細胞，檢測其中Arnt2 和Npas4 mRNA和蛋白表達水平〔11〕。本研究結(jié)果說明Arnt2高表達和Npas4低表達可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)功能受損，使患者出現(xiàn)情緒失調(diào)，引發(fā)認知障礙。