艾永斌， 楊旭升， 彭衛(wèi)華， 陳云梅， 徐涼燕， 羅劍， 夏云， 曾曉茂*

(1.四川申果莊省級(jí)大熊貓自然保護(hù)區(qū)管理處，四川越西616650； 2. 中國科學(xué)院成都生物研究所，成都610041；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

在兩棲動(dòng)物遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的相關(guān)研究中，為了獲取DNA，常常需要獲得動(dòng)物的組織樣品。早期研究往往采取損傷性取樣，即處死動(dòng)物后獲取樣品。隨著人們保護(hù)意識(shí)的提高，非損傷性取樣即非損傷性基因取樣得到廣泛應(yīng)用，包括剪趾法、活體組織檢查和針刺取血等方法(Maddocketal.，2014)。相比之下，非損傷性取樣既可以滿足生物學(xué)研究的要求，也在一定程度上保護(hù)了物種的生存和繁殖。

在非損傷性取樣方法中，剪趾法對(duì)兩棲動(dòng)物傷害最大，主要是因?yàn)閮蓷珓?dòng)物適應(yīng)水陸兩棲的生活，棲息環(huán)境中存在大量病菌，皮膚作為免疫防御機(jī)制對(duì)于兩棲動(dòng)物抵御病菌至關(guān)重要，因此，剪趾或者剪尾易導(dǎo)致兩棲動(dòng)物死亡。Parris等(2010)在3種無尾類中比較了口腔取樣、剪趾取樣、蝌蚪剪尾取樣對(duì)動(dòng)物的傷害程度，發(fā)現(xiàn)剪趾法對(duì)動(dòng)物傷害最大，在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，同時(shí)用消炎藥處理傷口的前提下，非損傷性取樣后西方蟾蜍Bufoboreas的死亡率為0.35%。此外，在野外兩棲動(dòng)物的監(jiān)測項(xiàng)目中，通常會(huì)采用剪趾法作標(biāo)志重捕，而剪趾會(huì)影響動(dòng)物的存活率和重捕率，進(jìn)而影響對(duì)整個(gè)種群數(shù)量的評(píng)估(McCarthyetal.，2009；吳軍等，2013)。

目前報(bào)道的用于兩棲動(dòng)物的非損傷性取樣方法有口腔擦拭取樣和體表皮膚擦拭取樣：Poschadel和M?ller(2004)描述了在陸龜科Testudinidae、蛙科Ranidae、蠑螈科Salamandridae、蟾蜍科Bufonidae動(dòng)物中通用的口腔取樣方法，即用1個(gè)小勺子輕輕打開動(dòng)物口腔，然后用棉簽沾取口腔內(nèi)的黏液；Broquet等(2007)在高山歐螈Triturusalpestris和無斑雨蛙Hylaarborea中驗(yàn)證了口腔擦拭得到的DNA樣品可以用于微衛(wèi)星分型研究；Mendoza等(2012)在卵齒蟾Eleutherodactylusjohnstonei中用棉簽擦拭表皮來獲取DNA樣品，并用16S rRNA做了分析；Guo等(2013)通過電極刺激中國大鯢Andriasdavidianus的體表，收集皮膚黏液和皮膚脫落物作為組織樣品；Maddock等(2014)在蚓螈目Gymnophiona 5個(gè)物種中嘗試了口腔擦拭、皮膚擦拭取樣，均成功獲取DNA。

迄今，采用口腔擦拭取樣在兩棲動(dòng)物中應(yīng)用較多，但此法受動(dòng)物個(gè)體限制，小型個(gè)體或幼體不易操作。相對(duì)而言，體表皮膚擦拭取樣應(yīng)用更廣泛，不受發(fā)育期的限制，適用于成體、幼體或蝌蚪期任一發(fā)育階段。但已知的皮膚擦拭取樣的研究局限于個(gè)別物種，能否普及到各類群尚不得知；另一方面，已知的取樣方法多為在實(shí)驗(yàn)室對(duì)活體的操作，不適用于野外就地取樣。基于此，本研究通過比較分析，嘗試野外就地體表擦拭取樣、野外就地干燥保存、DNA高效提取等方法，對(duì)四川申果莊省級(jí)大熊貓自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的有尾兩棲類及無尾兩棲類6科10屬11種進(jìn)行研究，以期驗(yàn)證體表擦拭取樣在野外工作中的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2017年4月和6月對(duì)四川申果莊省級(jí)大熊貓自然保護(hù)區(qū)(102°42′00″～102°54′17″E，28°28′13″～28°41′54″N)內(nèi)的有尾類及無尾類就地隨機(jī)取樣，共計(jì)6科10屬11種，采樣信息見表1。

表1 四川申果莊省級(jí)大熊貓自然保護(hù)區(qū)物種采樣信息Table 1 Information of samples collected from Shenguozhuang Provincial Giant Panda Nature Reserve， Sichuan

注： 物種分類系統(tǒng)按費(fèi)梁等(2009)和Frost(2017)

Note： The classification follows Feietal.， 2009 and Frost， 2017

1.2 取樣方法

1.2.1體表擦拭取樣輕輕捉住動(dòng)物，就地用流溪清水沖洗干凈，取無菌棉簽在體表(背部或腹部)擦拭至棉簽濕潤，然后將棉簽置入EP管。

1.2.2口腔擦拭取樣輕輕捉住動(dòng)物，就地用流溪清水沖洗干凈，用邊角圓潤的勺子輕輕打開口腔，將棉簽伸入口中，擦拭至棉簽濕潤，然后將棉簽置入EP管。

1.2.3剪趾取樣體表擦拭和口腔擦拭取樣結(jié)束后，剪取動(dòng)物第二節(jié)關(guān)節(jié)處的腳趾，保存在裝有95%乙醇的EP管中，取樣完成后將動(dòng)物就地釋放。

1.3 樣品的保存

棉簽擦試樣品(體表、口腔)置于密封袋中，EP管蓋敞開，袋中放硅膠，封住密封袋，待棉簽完全干燥(大約24 h)后合上EP管蓋。在野外可將樣品放置在常溫環(huán)境下(20～25 ℃)，待回到實(shí)驗(yàn)室將其保存在-20 ℃。剪趾樣本回到實(shí)驗(yàn)室后更換1次95%乙醇，-20 ℃保存。

1.4 DNA的提取

每個(gè)物種隨機(jī)抽取2～15個(gè)樣本，分2組提取DNA，其中一組用常規(guī)高鹽法提取，另一組用試劑盒提取。使用TIANGEN公司的口腔拭子基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)(TIANamp Swab DNA Kit，DP322)，根據(jù)說明書操作獲得DNA樣品，并于-20 ℃保存。

1.5 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增分別選取了16SrRNA通用引物1對(duì)、COⅠ專一引物1對(duì)以及COⅠ通用引物4對(duì)(表2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。25 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：12.5 μL Taq MIX(EasyTaqTMDNA Polymerase、dNTPs和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液反應(yīng)終濃度為2×，2×EasyTaq PCR SuperMix；全式金AS111-01，北京)；上、下游引物各1 μL；1 μL DNA模板；添加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，53 ℃(COⅠ)或者55 ℃(16SrRNA)退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.6 序列的測定與分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司成都測序部進(jìn)行ABI3730XL單向測序，使用PCR檢測時(shí)相對(duì)應(yīng)的上游引物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI中使用Nucleotide collection(nr/nt)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST物種比對(duì)分析，以相似性程度判斷相應(yīng)物種DNA非損傷性取樣是否成功。

表2 引物信息Table 2 Primers used in PCR

注： COⅠ-1/COⅠ-2為鈴蟾屬Bombina專一引物， 其余COⅠ引物為通用引物

Notes： COⅠ-1/COⅠ-2 is a specific primer ofBombina， and the rest are universal primers

2 結(jié)果

2.1 BLAST比對(duì)分析

共獲得11個(gè)物種34只個(gè)體的46個(gè)剪趾、體表、口腔樣本共計(jì)46條線粒體基因序列，同一個(gè)體不同來源樣本的相同基因序列一致。BLAST比對(duì)結(jié)果表明，受檢樣本物種基因序列匹配度除疣刺齒蟾Oreolalatrugosus的1個(gè)樣本為97%，其余各樣本均在99%以上，部分樣本達(dá)100%。每只個(gè)體上傳 1條基因序列到GenBank，共計(jì)上傳34只個(gè)體34條基因序列(附錄Ⅰ)。

2.2 DNA提取方法比較

采用不同的DNA提取方法，剪趾樣本獲得的DNA質(zhì)量沒有明顯差異，均能獲得目標(biāo)物種的線粒體DNA序列，擴(kuò)增測序成功率100%；而擦拭樣本所獲得的DNA質(zhì)量表現(xiàn)出一定程度的差異，進(jìn)而影響測序的成功率。

“在翻譯過程中，有時(shí)譯者想把源語所承載的各種文化信息轉(zhuǎn)譯到譯入語中，因此“直譯”是他們的第一選擇。直譯帶有濃厚的源語文化痕跡”（趙德全，2009）。[14]

在對(duì)所有樣本使用相同引物(16SrRNA通用引物)的前提下，通過高鹽法提取擦拭樣本(口腔、體表)的DNA質(zhì)量相對(duì)較弱，部分樣本不能獲得物種基因序列，共提取DNA樣本27個(gè)，測序成功 21個(gè)，成功率為78%。而通過試劑盒提取擦拭樣本的DNA質(zhì)量良好，共提取DNA樣本12個(gè)，測序成功率達(dá)100%(表4)。

表3 線粒體序列BLAST比對(duì)結(jié)果Table 3 BLAST results of the mitochondrial sequence

普雄原鯢Pseudohynobius puxiongensisYXS12-1COⅠ√/—/—P. puxiongensis100山溪鯢Batrachuperus pinchoniiYXS86COⅠ√/—/—Ba. pinchonii99YXS87COⅠ√/—/—Ba. pinchonii99YXS91COⅠ—/—/√Ba. pinchonii99續(xù)表3物種Species樣本SampleCOⅠ/16S rRNA體表/口腔/剪趾Skin/mouth/toe匹配物種Matching species in GenBank相似性Identity/%沙坪角蟾Atympanophrys shapingensisYXS11-316S rRNA√/—/—At. shapingensis100YXS71-116S rRNA√/—/—At. shapingensis100YXS77-116S rRNA—/√/—At. shapingensis100棕點(diǎn)湍蛙Amolops loloensisYXS79-1COⅠ√/—/—Am. loloensis100YXS83-1COⅠ√/—/—Am. loloensis100YXS53-4COⅠ—/—/√Am. loloensis100昭覺林蛙Rana chiaoensisYXS60-1COⅠ√/—/—Ra. chaochiaoensis100YXS89COⅠ—/—/√Ra. chaochiaoensis100寶興樹蛙Rhacophorus dugriteiYXS65-116S rRNA√/—/—Rh. dugritei99YXS82-116S rRNA√/—/—Rh. dugritei99

注： YXS65-1中， YXS65為野外采集標(biāo)本號(hào)， -1為該標(biāo)本所取的剪趾， 或體表擦拭， 或口腔擦拭樣本號(hào)； 下同

Note： YXS65 is number of the field collected specimen， -1 is the ID of the specimen from the toe， skin， or mouth； the same below

2.3 不同引物比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，剪趾樣本使用4種通用COⅠ引物均可擴(kuò)增并成功測序。而擦拭樣本在模板全部使用試劑盒提取DNA的前提下，運(yùn)用6對(duì)不同線粒體基因引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增，不同類群物種明顯受引物特異性的局限，擴(kuò)增成功率受到明顯影響。COⅠ通用引物VR1d/VF1d僅中華蟾蜍華西亞種Bufogargarizansandrewsi擴(kuò)增并測序成功；通用引物F/R也僅在棕點(diǎn)湍蛙Amolopsloloensis和昭覺林蛙Ranacliaoensis2個(gè)物種中擴(kuò)增成功。4對(duì)COⅠ通用引物均不能在大蹼鈴蟾Bombinamaxima中擴(kuò)增成功，只有使用鈴蟾屬Bombina專一引物才成功獲得該物種序列。16SrRNA通用引物雖然在角蟾科Megophryidae物種以及樹蛙科Rhacophoridae物種中可以成功擴(kuò)增，但卻不能擴(kuò)增鈴蟾科Bombinatoridae物種大蹼鈴蟾(表5)。

3 討論

3.1 DNA體表擦拭取樣的應(yīng)用

已有的兩棲類體表擦拭取樣的研究比較局限，只在零星的幾個(gè)物種中有報(bào)道。Mendoza等(2012)從離趾蟾Eleutherodactylusjohnstonei的68只個(gè)體中獲取體表涂抹樣本，使用DNeasy提取試劑盒、鹽析、酚-氯仿抽提等方法提取DNA，并通過擴(kuò)增16SrRNA的線粒體基因比較了提取DNA的質(zhì)量，證明在該物種中獲取上皮脫落組織是可用的。Pichlmüller等(2013)利用皮膚擦拭取樣在火蠑螈Salamandrasalamandra的幼體中獲得DNA并完成了微衛(wèi)星分型。

本研究對(duì)四川申果莊省級(jí)大熊貓保護(hù)區(qū)內(nèi)的6科10屬11種兩棲動(dòng)物隨機(jī)就地體表擦拭取樣，這些動(dòng)物涵蓋有尾及無尾兩棲類多個(gè)類群的多個(gè)物種，并涉及多種生境類群。通過對(duì)PCR產(chǎn)物的測序分析，在所有受檢物種中，研究獲得的COⅠ序列和16SrRNA序列與GenBank中相應(yīng)物種的序列相似性均在97%以上，絕大部分樣本匹配度達(dá)到99%和100%，表明擦拭獲得的DNA均可以擴(kuò)增獲得目標(biāo)物種序列。

由此說明，體表擦拭獲取DNA的方法在兩棲動(dòng)物各類群中可以廣泛應(yīng)用。

表4 不同方法提取不同物種樣本的結(jié)果比較Table 4 Comparison of extracted DNA in different sample of species by different methods

注Note： ×/—/— 測序失敗的體表樣本the skin sample of failing to sequence

表5 不同引物擴(kuò)增獲得的測序成功率Table 5 The sequencing success rate of PCR amplification using 6 primers

注： 引物Chmf4/Chmr4、COⅠ-CO2/COⅠ-CO4和COⅠ-CO1/COⅠ-CO3混合使用， 即上游引物Chmf4、COⅠ-CO2、COⅠ-CO1混合記作F， 下游引物Chmr4、COⅠ-CO4、COⅠ-CO3混合記作R； √ 該號(hào)樣本擴(kuò)增并測序成功， × 未成功， — 未進(jìn)行該引物檢測

Notes： Primers Chmf4/Chmr4， COⅠ-CO2/COⅠ-CO4 and COⅠ-CO1/COⅠ-CO3 were mixed and used in PCR， the upstream primers Chmf4， COⅠ-CO2 and COⅠ-CO1 are denoted as F， and the downstream primers Chmr4， COⅠ-CO4， COⅠ-CO3 mixture are denoted as R；√ indicates successful PCR amplification and DNA sequencing， × indicates failed PCR amplification and DNA sequencing， — indicates the detection was not carried out

3.2 DNA提取方法的影響

與剪趾樣本相比，體表擦拭獲得的DNA質(zhì)量較差。同時(shí)，擦拭樣本DNA提取難度更大，不同的DNA提取方法獲得的DNA質(zhì)量存在一定差異。其中，高鹽法可獲取數(shù)量較多的DNA，但所獲DNA純度較低，混有較多脂類、蛋白質(zhì)等有機(jī)物，這些雜質(zhì)可能影響PCR擴(kuò)增成功率；而試劑盒提取雖然會(huì)造成DNA量的損失，但可獲得純度更高的DNA，PCR擴(kuò)增成功率更高(邵勁松等，2013；李霞等，2015)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在使用同一對(duì)引物P7/P8的前提下，隨機(jī)抽取的5個(gè)物種以試劑盒提取的DNA擴(kuò)增測序成功率為100%，高于高鹽法的78%。Mendoza等(2012)的研究中，使用試劑盒和鹽析法提取的DNA均成功地?cái)U(kuò)增到了16SDNA片段，其中，試劑盒提取的DNA擴(kuò)增成功率(90%)比高鹽法(80%)的高。

因此，針對(duì)體表擦拭樣本，建議使用試劑盒提取DNA。

3.3 引物特異性的影響

與剪趾樣本相比，體表擦拭獲得的DNA量較少，含有較多環(huán)境細(xì)菌等非目標(biāo)物種的DNA。因通用性較強(qiáng)的引物對(duì)非目標(biāo)物種DNA也同樣擴(kuò)增，甚至?xí)a(chǎn)生優(yōu)勢擴(kuò)增情況，導(dǎo)致目標(biāo)物種擴(kuò)增失敗，因此，體表擦拭樣本在提取DNA時(shí)對(duì)引物專一性的要求有所增加。

實(shí)際上，同類非損傷性取樣研究中，研究者多針對(duì)其研究類群，設(shè)計(jì)專一引物獲得目標(biāo)物種基因序列。Prunier等(2012)在2種兩棲類物種中用非損傷性取樣的DNA樣本完成了14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因分型研究，對(duì)每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)專門設(shè)計(jì)了特異性引物。針對(duì)離趾蟾完成的非損傷性取樣測序檢測，設(shè)計(jì)了特異性的16SrRNA引物(Mendozaetal.，2012)。Simon等(1994)在蚓螈目5個(gè)種的研究中也使用了特異性的16SrRNA和POMC引物。

體表擦拭取樣獲得的DNA量小且成分相對(duì)復(fù)雜，因此，建議針對(duì)各類群設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增測序，以達(dá)到良好的目標(biāo)物種擴(kuò)增成功率。

致謝：野外數(shù)據(jù)采集得到四川省申果莊大熊貓自然保護(hù)區(qū)拉吉保護(hù)站、石門保護(hù)站和四川省林業(yè)廳野生動(dòng)植物與自然保護(hù)區(qū)管理處和管理站工作人員的大力支持，謹(jǐn)此深表謝意！

附錄Ⅰ 受檢標(biāo)本信息(括號(hào)中為各標(biāo)本上傳GenBank的COⅠ或16S rRNA序列號(hào)，其中COⅠ序列用下劃線標(biāo)出)Appendix Ⅰ Specimens examined for COⅠ and 16S rRNA genes (GenBank accession numbers are in parentheses， and COⅠ sequences are underlined)