高燕燕， 李琳， 趙禹， 朱妞， 楊純

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004)

蜥蜴亞目Sauria視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和機(jī)能與各自的生活習(xí)性一致(張育輝，賈林芝，2003)，且具有特殊的視覺再生能力(Langetal.，2002)。視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的增齡改變必然影響機(jī)體的視覺功能(孫慶艷等，2004)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)可反映其功能活動(dòng)狀態(tài)(Biginietal.，2001；Williams，2017)。視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中表達(dá)GFAP是成體脊椎動(dòng)物的共同特征(Sassoèetal.，1992)。GFAP在無(wú)蹼壁虎Gekkoswinhonis視網(wǎng)膜中的分布特點(diǎn)及年齡相關(guān)性變化，提示Müller細(xì)胞可能通過(guò)增強(qiáng)或減弱GFAP表達(dá)參與視網(wǎng)膜衰老過(guò)程中的生理功能調(diào)節(jié)(王智超等，2008)。

秦嶺滑蜥Scincellatsinlingensis是我國(guó)特有的卵胎生蜥蜴(趙爾宓，1999)，為《國(guó)家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究?jī)r(jià)值的野生動(dòng)物名錄》收錄物種(王志寶，2000)，相關(guān)研究局限于其部分器官系統(tǒng)的組織形態(tài)學(xué)(謝權(quán)等，2012；王麗敏等，2015，2016；Yang & Wang，2016；Yangetal.，2017)，尚無(wú)視網(wǎng)膜顯微結(jié)構(gòu)增齡性變化的相關(guān)報(bào)道。因此，對(duì)秦嶺滑蜥幼體、亞成體和成體視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)以及GFAP陽(yáng)性表達(dá)變化進(jìn)行探究，旨在積累蜥蜴類爬行動(dòng)物視覺器官發(fā)育的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

秦嶺滑蜥采自山西省霍州市太岳山七里峪林區(qū)(110°40′～112°21′E，36°21′～36°45′N)，雌雄兼有。根據(jù)吻肛長(zhǎng)(SVL)分為幼體組(SVL<48.08 mm)、亞成體組(48.08 mm≤SVL≤57.08 mm)、成體組(SVL>57.08 mm)(馬小梅，計(jì)翔，2001；王麗敏，2016)，每組6只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)乙醚麻醉致死后，剝離眼球，置于不同固定液中。

1.2 常規(guī)組織化學(xué)染色

材料經(jīng)Bouin’s液固定后，梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，8 μm連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

材料經(jīng)4%多聚甲醛固定過(guò)夜后，放入蔗糖溶液中梯度脫水，OCT包埋劑包埋，連續(xù)冰凍切片，切片厚度20 μm，-20 ℃保存，用于GFAP免疫組織化學(xué)染色。反應(yīng)流程依次為：4%多聚甲醛后固定30 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗(0.1 mol·L-1，pH7.2～7.6)，5 min×3次；3%H2O2室溫下避光20 min；PBS浸洗，5 min×3次；5%BSA封閉液，室溫孵育30 min；滴加一抗：Rabbit anti-GFAP(1∶200，博士德)，4 ℃孵育過(guò)夜；PBS浸洗，5 min×3次；滴加二抗：生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(博士德)，37 ℃孵育4 h；PBS浸洗，5 min×3次；滴加SABC(博士德)，37 ℃孵育30 min；PBS浸洗，5 min×3次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；水溶性封片劑封片。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)采用PBS代替一抗，其余步驟同上。

1.4 觀察與統(tǒng)計(jì)分析

切片于Olympus BX-51光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)下進(jìn)行觀察，拍照。每張切片隨機(jī)選取8個(gè)視野測(cè)量視網(wǎng)膜總厚度及各層厚度(單位：mm)。利用ImageJ隨機(jī)選取10個(gè)視野(40×10)，測(cè)定各組視網(wǎng)膜GFAP免疫陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值。灰度分為0～256級(jí)，值越小，免疫陽(yáng)性反應(yīng)越強(qiáng)。采用SPSS 17.0中的Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布后，再進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著性水平設(shè)置為α=0.01(楊純，張育輝，2003)。

2 結(jié)果

2.1 秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜顯微結(jié)構(gòu)

光學(xué)顯微鏡下可見秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜從內(nèi)到外共分為10層：內(nèi)界膜、神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、外核層、外界膜、視桿視錐層、色素上皮層(圖版Ⅰ：1～3)。內(nèi)界膜為無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的單層薄膜；神經(jīng)纖維層從視網(wǎng)膜的四周伸向中央視盤，中間厚、邊緣??；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層分布密度不均，從中央到邊緣由稠密逐漸稀疏，胞核較大，核仁明顯；內(nèi)網(wǎng)狀層最厚，由雙極細(xì)胞的軸突、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞的樹突和節(jié)細(xì)胞的樹突組成；內(nèi)核層3～5層，胞核圓，分布有雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、網(wǎng)間細(xì)胞和Müller細(xì)胞等；外網(wǎng)狀層主要是內(nèi)核層的纖維末梢與內(nèi)核層的水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞的神經(jīng)突起接合的地方，也含有Müller細(xì)胞的纖維側(cè)枝；外核層由2層感光細(xì)胞核組成，核周質(zhì)較少，2層細(xì)胞核交錯(cuò)排列，靠近外界膜一層的核較大，卵圓形，為視錐細(xì)胞核，靠近外網(wǎng)狀層一層的核較小，圓形，為視桿細(xì)胞核；外界膜由Müller細(xì)胞的外突以及視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的連接復(fù)合體形成；視桿視椎層由視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的內(nèi)、外節(jié)組成；色素上皮層位于視網(wǎng)膜最外側(cè)，細(xì)胞呈柱形，胞核偏于外側(cè)，胞質(zhì)內(nèi)密布黑色素顆粒，大量含有色素顆粒的突起向內(nèi)延伸至緊鄰的視桿視錐層的外節(jié)處，與脈絡(luò)膜交界。

2.2 不同年齡組視網(wǎng)膜各層厚度和胞核數(shù)的比較

不同年齡組秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜的10層結(jié)構(gòu)均清晰易辨(圖版Ⅰ：1～3)。單因素方差分析結(jié)果顯示，亞成體和成體視網(wǎng)膜總厚度較幼體明顯增加(P<0.01)，但三者之間的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、外界膜以及視桿視錐層厚度無(wú)明顯差異。從幼體經(jīng)亞成體到成體，神經(jīng)纖維層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、外界膜逐漸增厚，而內(nèi)界膜、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、外核層、色素上皮層、視桿視錐層先增厚再變薄。與幼體相比，亞成體視網(wǎng)膜中內(nèi)界膜和外核層厚度顯著增加，其他無(wú)明顯差異；成體視網(wǎng)膜中神經(jīng)纖維層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、外核層和色素上皮層厚度顯著增加(表1)。

表1 不同年齡組秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜各層厚度比較Table 1 The thickness of the retinal layers of Scincella tsinlingensis at different ages

注： 同行數(shù)據(jù)中， 標(biāo)有完全不同的小寫字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

Note： In the same column， difference is significant with the completely different lowercase letters (P<0.01)

秦嶺滑蜥個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，視網(wǎng)膜細(xì)胞核層數(shù)變化不大。外核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞核層數(shù)相當(dāng)，內(nèi)核層細(xì)胞核數(shù)目較多(表2)。

表2 不同年齡組秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜細(xì)胞核層數(shù)Table 2 Layer number of nucleus in the retina of Scincella tsinlingensis at different ages

2.3 不同階段視網(wǎng)膜GFAP陽(yáng)性表達(dá)變化

不同年齡組視網(wǎng)膜GFAP免疫陽(yáng)性主要定位于內(nèi)界膜和神經(jīng)纖維層，且以神經(jīng)纖維層陽(yáng)性最強(qiáng)。GFAP陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)成體最強(qiáng)、幼體較強(qiáng)、亞成體最弱的年齡相關(guān)性(表3)。在亞成體階段，可觀察到視桿視錐層有少量GFAP陽(yáng)性表達(dá)，視網(wǎng)膜其余各層均未見GFAP陽(yáng)性表達(dá)(圖版Ⅰ：4～9)。

表3 不同年齡組秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)灰度值比較Table 3 Comparison of the gray levels of retinal glial fibrillary acidic protein expression of Scincella tsinlingensis at different ages

注Note：*P<0.01

圖版Ⅰ 不同年齡組秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白的陽(yáng)性表達(dá)
PlateⅠ Microstructure and immunohistochemical localization of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the retina ofScincellatsinlingensisat different ages

1～3. 秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)(1. 幼體， 2. 亞成體， 3. 成體)， 4～9. 秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜GFAP免疫組織化學(xué)定位， GFAP陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色(4、 7. 幼體， 5、 8. 亞成體， 6、 9. 成體)； RPE. 色素上皮層， RCL. 視桿視錐層， OLM. 外界膜， ONL. 外核層， OPL. 外網(wǎng)狀層， INL. 內(nèi)核層， IPL. 內(nèi)網(wǎng)狀層， GCL. 神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層， NFL. 神經(jīng)纖維層， ILM. 內(nèi)界膜

1-3. the microstructure of the retinal layers (1. juvenile， 2. subadult， 3. adult)， 4-9. immunohistochemical localization of GFAP in the retina， GFAP positive cells are brown (4， 7. juvenile， 5， 8. subadult， 6， 9. adult)； RPE. retinal pigment epithelium， RCL. layer of rods and cones， OLM. outer limiting membrane， ONL. outer nuclear layer， OPL. outer plexiform layer， INL. inner nuclear layer， IPL. inner plexiform layer， GCL. ganglion cells layer， NFL. nerve filament layer， ILM. inner limiting membrane

3 討論

秦嶺滑蜥的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與大多數(shù)脊椎動(dòng)物相似，從內(nèi)到外共分為10層。晝行性動(dòng)物和夜行性動(dòng)物視網(wǎng)膜的主要差異之一是感光細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目之比不同。前者視網(wǎng)膜、外核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)目相當(dāng)，且細(xì)胞核層數(shù)較少，內(nèi)核層細(xì)胞核數(shù)目較多，而后者視網(wǎng)膜外核層的細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)多于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(鮑義恒，陳云俊，1979；王厚華等，1980；張育輝，劉家坤，1994；張育輝，賈林芝，2003)。秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜的外核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目之比均相當(dāng)，細(xì)胞核層數(shù)上，外核層1～2層，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層3～4層，而內(nèi)核層6～8層，符合晝行性動(dòng)物視網(wǎng)膜的特征，故推測(cè)秦嶺滑蜥為晝行性動(dòng)物。

秦嶺滑蜥、銅蜥Lygosomaindicum、北草蜥Takydromusseptentrionalis及麗斑麻蜥Eremiasargus均為晝行性動(dòng)物，捕食主要依賴視覺，視網(wǎng)膜總厚度相近，各層厚度也較接近，其中，視桿視錐層和外核層細(xì)胞核層數(shù)均較少，相對(duì)較薄，且以視錐細(xì)胞的錐部為主，視錐細(xì)胞比視桿細(xì)胞粗短，細(xì)胞核較少但直徑較大；它們與夜行性或晨昏性活動(dòng)的無(wú)蹼壁虎、耳疣壁虎Gekkoauriverrucosus視網(wǎng)膜總厚度相差較大，后者的視桿視錐層和外核層細(xì)胞核層數(shù)均較多，相對(duì)較厚，以視桿細(xì)胞為主，且比視錐細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)而密集，細(xì)胞核較多但直徑較小，這有助于增加吸收光線的面積，從而提高光敏度，有利于夜間活動(dòng)(張育輝，賈林芝，2003)。秦嶺滑蜥亞成體和成體視網(wǎng)膜總厚度較幼體明顯增加，但三者神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、外界膜以及視桿視錐層厚度之間無(wú)明顯差異。幼體視桿視錐層較薄，其中視桿細(xì)胞較多而視錐細(xì)胞較少，與其活動(dòng)性較弱相適應(yīng)。亞成體活動(dòng)性逐漸增強(qiáng)，視網(wǎng)膜的視桿視錐層亦增厚，利于白天活動(dòng)。成體視桿視錐層最薄，視桿視錐層結(jié)構(gòu)改變，主要由視錐細(xì)胞較為粗短的錐部組成。與幼體相比，亞成體和成體視網(wǎng)膜總厚度增加極顯著，亞成體視網(wǎng)膜中內(nèi)界膜和外核層厚度顯著增加，成體視網(wǎng)膜中神經(jīng)纖維層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、外核層和色素上皮層厚度顯著增加。上述結(jié)果表明，秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜各層厚度與年齡呈相關(guān)性，反映其視覺功能的發(fā)育特點(diǎn)。

GFAP是膠質(zhì)細(xì)胞特有的一種中間絲蛋白，用于標(biāo)記分化的膠質(zhì)細(xì)胞(Sueishietal.，1996；孫慶艷等，2004)，參與細(xì)胞支架重組、髓鞘形成、細(xì)胞黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等復(fù)雜過(guò)程(Biginietal.，2001；薛黎萍等，2010；鄧海波等，2012)。GFAP主要在秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的Müller細(xì)胞中分布，與Sassoè等(1992)的報(bào)道一致：Müller細(xì)胞內(nèi)側(cè)端的胞體、突起和膨大的終足是GFAP陽(yáng)性顆粒分布的主要區(qū)域。GFAP陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)幼體較強(qiáng)，亞成體最弱，而成體最強(qiáng)的年齡相關(guān)性。秦嶺滑蜥幼體階段視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞表達(dá)GFAP較強(qiáng)，這可能是由于Müller細(xì)胞膠質(zhì)化增生在視網(wǎng)膜早期階段具有修復(fù)作用(鄧海波等，2012)。Müller細(xì)胞中GFAP表達(dá)變化類似星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后的反應(yīng)，星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)增加表現(xiàn)為反應(yīng)性星形膠質(zhì)化，且GFAP在其細(xì)胞內(nèi)的分布對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞突起的形成和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定至關(guān)重要(柯技等，2007)。Müller細(xì)胞與吞噬細(xì)胞相似，能夠清除神經(jīng)元變性壞死產(chǎn)生的碎片及代謝產(chǎn)物，避免這些物質(zhì)對(duì)周圍存活神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，并且活化的Müller細(xì)胞能夠合成和分泌多種細(xì)胞因子，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、細(xì)胞粘連分子(跨膜糖蛋白CIM)、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白及其他細(xì)胞外基質(zhì)組成成分(Hottaetal.，1995)，對(duì)維持神經(jīng)元的生存、發(fā)育、再生和分化有重要作用(Schellinietal.，1995)。據(jù)此推測(cè)Müller細(xì)胞能夠維持秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜穩(wěn)定，對(duì)視神經(jīng)增殖和生長(zhǎng)發(fā)育也有一定的影響，為再生視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞提供豐富的黏著基質(zhì)，從而起支持作用(Romero-Alemánetal.，2004；王智超等，2008)。

綜上所述，秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與其生活習(xí)性相適應(yīng)，GFAP陽(yáng)性表達(dá)的年齡相關(guān)性變化反應(yīng)其視覺功能的發(fā)育特點(diǎn)，并可能與視網(wǎng)膜的生理功能調(diào)節(jié)相關(guān)。