劉 陽，葛武鵬,*，張 靜，郭春鋒，梁秀珍，王 智，張興吉，王 瑞

（1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省飛天乳業(yè)有限公司，陜西 寶雞 721100；3.陜西百躍優(yōu)利士乳業(yè)有限公司，陜西 咸陽 712000）

蠟樣芽孢桿菌屬由多個生理生化特性高度相似的革蘭氏陽性菌群組成，主要包括蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、炭疽芽孢桿菌（B. anthraics）、蕈狀芽孢桿菌（B. mycoides）、假蕈狀芽孢桿菌（B. pseudomycoides）、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）、細胞毒素芽孢桿菌（B. cytotoxicus）、圖瓦永芽孢桿菌（B. toyonensis）及韋氏芽孢桿菌（B.weihenstephanensis）8 種[1-2]。其中B. cereus因產(chǎn)高黏附能力的孢子而在自然界中廣泛存在，是一種易引起人畜共患疾病的病原菌[3]，主要代謝物有嘔吐毒素、細胞毒素K、溶血性腸毒素BL和非溶血性腸毒素等，可引起嘔吐、腹瀉等臨床癥狀，在中國因其引發(fā)的食物中毒事件總量僅次于沙門菌，嬰幼兒等低免疫人群感染后可誘發(fā)心膜炎、菌血癥和腦膜炎等并發(fā)癥，甚至危及生命[4-7]。乳粉生產(chǎn)工藝中的巴氏殺菌、超高溫瞬時殺菌、濃縮、噴霧干燥等環(huán)節(jié)可確保殺滅蠟樣芽孢桿菌等所有致病微生物的菌體細胞，但具有耐熱特性的孢子極易在特定條件下萌發(fā)，轉為繁殖細胞，使其代謝產(chǎn)物在終產(chǎn)品中存在而誘發(fā)食源性疾病[8-9]。在食品安全管控中生物性危害在各國均是最為嚴苛的，在我國各類食品中亦有嚴格限量規(guī)定，特別是嬰幼兒配方食品[10-11]。我國規(guī)定不同食品中蠟樣芽孢桿菌的菌落總數(shù)應小于103～105CFU/g（CFU/mL），并且其在嬰幼兒配方食品中作為致病風險指標也是主要監(jiān)控的生物性危害之一[12-13]。近年來有關B. cereus的研究主要集中在糧食類餐食方面，如有學者[14-15]研究了炒米飯和大米分離株的毒力基因、致病機理、基因進化關系，有關嬰幼兒配方食品的研究大多體現(xiàn)在對其分離株及其毒力基因表達上，而關注于生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)的研究偏少，特別是對于羊奶粉加工環(huán)節(jié)得到的分離株基因進化關系的研究更是鮮見報道[16]。

隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplification polymorphic DNA，RAPD）采用一條隨機引物進行基因擴增，可用于較大樣本量的初步分型，但無法得到分離株之間的基因進化關系[17-19]。多位點序列分型（multiple locus sequence typing，MLST）是一種基于7 個管家基因的分子分型技術，其采用雙向測序以得到精確、分辨率較高的結果，運用非加權平均數(shù)（unweight pair-group method using arithmetic averages，UPGMA）、基于相關序列（based upon related sequence types，BURST）等算法對結果進行分型分析，且建有實現(xiàn)數(shù)據(jù)全球共享的平臺——MLST國際數(shù)據(jù)庫（PubMLST Database）[20-22]。該數(shù)據(jù)庫涵蓋了B. cereus、金黃色葡萄鏈球菌（Staphylococcus aureus）、白色念珠菌（Candida albicans）等108 種微生物以及噬菌體、質粒的MLST方案，其中B. cereus的PubMLST Database建立于2004年，實現(xiàn)了不同國家、不同地區(qū)、不同實驗室實驗結果的比對和溯源性分析，使得臨床和食源性分離株的遺傳多樣性得到廣泛研究[6,23]。本實驗對經(jīng)RAPD初步分型得到的42 株B. cereus進行MLST分型分析，探究出嬰幼兒配方羊乳粉加工生產(chǎn)環(huán)節(jié)得到的分離株的基因多樣性和系統(tǒng)進化關系，為其溯源和有效防控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

2016年7月—2016年11月于陜西省A、B、C三家羊乳粉廠采集嬰幼兒配方粉各生產(chǎn)環(huán)節(jié)及工廠周邊土壤樣共計970 份，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）分子鑒定得到B. cereus分離株350 個，保存于-80 ℃冰箱備用。

本實驗的質控菌株為B. c e r e u s標準菌株CGMCC1.1846。

1.1.2 MLST分型菌株的來源

采用RAPD技術對350 株陽性菌初步分型，聚類分析后得到8 個獨立株和12 簇（相似度≥95%），將所有獨立株（8 個）和隨機選取各簇的3 株菌（34 個）進行MLST基因分型。本研究所用的分離株是經(jīng)RAPD初步分型得到的。

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑

胰酪胨大豆多黏菌素肉湯基礎、甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂基礎、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、腦心浸液肉湯（BHI） 北京陸橋技術有限公司。

多黏菌素B、50%卵黃液 北京陸橋技術有限公司；乙二胺四乙酸、Tris 美國Sigma公司；瓊脂糖美國HydraGene公司；PCR Premix Taq、引物 日本Takara公司；DuRed核酸染料 北京泛博生化有限公司。

1.2 儀器與設備

T100TMThermal Cycler PCR儀、GEL DOC XR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；SB4200DT移液器 德國Eppendorf公司；SW-CJ-2D超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；DH-500電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科偉永興儀器有限公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分離株DNA的提取

將保存的B. cereus分離菌株接種于BHI培養(yǎng)基于30 ℃過夜振蕩培養(yǎng)（轉速180 r/min），取2 mL培養(yǎng)好的菌懸液于無菌離心管以5 000×g離心5 min，棄上清液，加1 mL TE緩沖液重懸，將重懸液以5 000×g離心5 min，棄上清液后再取100 μL TE緩沖液重懸，100 ℃熱裂解20 min，裂解后立即冰浴10 min，再以13 000 r/min的轉速離心10 min，收集上清液即為DNA模板，于-20 ℃保存?zhèn)溆肹25]。

1.3.2 MLST基因分型

根據(jù)PubMLST Databases中B. cereus的MLST方案（http://pubmlst.org/bcereus/info/primers.shtml），對初步分型得到的42 株目標菌的7 個管家基因進行擴增測序，從而得到相應的序列類型。

1.3.2.1 管家基因片段擴增

B. cereus的7 個管家基因的擴增引物如表1所示。

表1 B. cereus管家基因Table1 Seven house-keeping genes of B. cereus

反應體系5 0 μ L：D N A模板5 μ L，PCR Premix Taq 25 μL，正向引物和反向引物各1 μL（終濃度0.2 μmol/L），超純水18 μL。擴增反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，56～59 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，終產(chǎn)物4 ℃保藏。取擴增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠進行110 V恒壓電泳35 min，在凝膠成像系統(tǒng)中得到DNA指紋圖譜，將成像結果是目標條帶單一清晰且無非特性雜帶的擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）有限公司進行雙向測序。

1.3.2.2 等位基因及基因序列的上傳比對

將7 個管家基因的正反雙向引物擴增產(chǎn)物的測序結果進行拼接并上傳至PubMLST Database進行基因序列比對，得到相應的Aelle ID，將比對過的7 個等位基因序列號上傳后得到相應的序列類型MLST profiles。對于有基因變異和多態(tài)性位點變異的序列，向數(shù)據(jù)庫提交新序列分離株的信息并申請分離株號（PubMLST ID），申請并提交相應的新型基因的驗證信息，得到新型的等位基因和序列類型。

1.3.2.3 MLST克隆復合物（clonal complex，CC）的聚類分析

使用BioNumerics vision 7.6處理42 株分離株的等位基因和序列類型，建立最小生成樹，同時按照UPGMA算法構建聚類樹，分析其遺傳進化關系。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用BioNumerics version 7.6完成序列的拼接和與已上傳數(shù)據(jù)的序列比對，得到不同的ST型，以UPGMA法建立不同ST型的聚類樹；將本研究得到的分離株基因序列與國際數(shù)據(jù)庫PubMLST Database中的基因序列比對分析，采用在線BURST（n-4）算法進行分離株CC的聚類分析，使用Phylo Tree建立系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 管家基因PCR結果

圖1 B. cereus七個管家基因的凝膠成像圖Fig.1 PCR amplif i cation of house-keeping genes from B. cereus isolates

不同管家基因的特異性引物進行PCR反應后的產(chǎn)物凝膠成像如圖1所示，特異性引物均能擴增出單一清晰的目標條帶。MLST方案中有3 個備選引物，劉勇[15]使用備選引物ilvD_2（F：5’-AGATCGTATTACTGCTACGG-3’；R：5’-GTTACCATTTGTGCATAACGC-3’）對大米中致吐型B. cereus進行MLST分型擴增，而本研究只使用基于基本方案的引物進行擴增，主要原因可能是前者研究的目標基因是嘔吐型毒素，而ilvD_2是針對產(chǎn)嘔吐毒素分離株設計的特異性引物。Li Fan等[25]研究表明不同的食物得到的分離株具有不同的毒力基因，而我國食源性B. cereus分離株的毒力基因主要是腸毒素基因。由此初步推斷陜西省嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)鏈中的B. cereus分離株沒有產(chǎn)嘔吐素的典型基因。

2.2 MLST分型結果

圖2 42 株B. cereus分離株ST型聚類樹Fig.2 Clustering dendrogram of 42 B. cereus isolates

42 株分離株MLST分型的結果如圖2所示，共7 個ST型，分別為ST-1348、ST-1349、ST-1350、ST-1351、ST-1084、ST-1000和ST-770，其MLST CC有142、205和23三種。4 個成品粉分離株的基因型為ST-1084，其余2 個為ST-1000。Yang Yong等[16]采用MLST技術對中國嬰幼兒食品B. cereus分離株分型，得出ST-1062的菌株為中國羊乳特征分離株，而本研究的分離株并沒有得到具有此基因型的菌株；與此同時，本實驗所用的原料羊乳樣品經(jīng)分離鑒定后，發(fā)現(xiàn)其污染率為0%（0/15），因此可排除原料羊乳是嬰幼兒配方羊乳粉污染B. cereus源頭的可能。Kovac等[26]將乳源分離株通過MLST分析分為21 個不同的ST型，其中有16 個新的基因型，本研究將得到的嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)鏈分離株分為7 個ST型，其中ST-1348、ST-1349、ST-1350、ST-1351為4 個新型ST型，glp-253、glp-254、ilv-277、pyc-199為4 個新型等位基因；此外，PubMLST Database數(shù)據(jù)顯示[27]，從2015年我國乳制品分離株首次上傳至今已有70 個乳源分離株在庫，分為68 個ST型（圖3），本研究得到的ST-1348、ST-1049、ST-1051包含在內，表明乳制品分離株具有遺傳多樣性。因此，本研究基因序列的進化關系需要進行進一步BURST（n-4）和MLST CC分析。

圖3 我國乳制品B. cereus分離株[28]的ST型及進化樹Fig.3 Sequence types and phylogenetic tree of B. cereus strains isolated from milk products in China

2.3 MLST CC分析結果

將42 株分離株的ST型及其CC建立最小生成樹，如圖4所示，ST-1000隸屬CC 142，ST-1084隸屬于CC 205，ST-770與ST-1084與其他ST型相比具有較近的親緣關系，ST-1348隸屬于CC 23。

將本研究得到的ST-770、ST-1000、ST-1084、ST-1348、ST-1349、ST-1350、ST-1351與其CC ST-142、ST-23運用數(shù)據(jù)庫在線BURST（n-4）工具分為3 組（Group）和3 個獨體，ST-23和ST-1348同屬Group 1，ST-142、ST-1000同屬Group 2，ST-770、ST-1084、ST-205同屬Group 3，獨體ST-1349和獨體ST-1350分別是上粉器內壁分離株3L33和土壤分離株3L47的基因型，獨體ST-1351是純羊奶粉分離株1Y55、乳糖粉分離株1Y58、輔料室地面分離株5L45的基因型。BURST的結果與最小生成樹的結果一致，相互驗證分離株的親緣進化關系。Dohmae等[28]的研究闡明B. cereus食源性分離株的基因型主要為ST-26、ST-142、ST-381，本研究得到的ST-1000（與ST-142基因型同屬）與其基因型一致。張翼[29]采用MLST技術將11 株產(chǎn)嘔吐毒素的分離株的基因型分為ST-26和ST-989，并使用BURST工具探究其親緣關系，其與本研究使用的分析方法相同，但沒有得到相同的ST型，這可能是因為嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)鏈的分離株不表達致嘔吐毒素的基因[21]。

圖4 42 株B. cereus分離株的最小生成樹Fig.4 Minimum spanning tree of 42 B. cereus isolates

2.4 不同來源分離株ST型的比對分析

我國已上傳至PubMLST Database的B. cereus分離株共153 個，與之對應的基因型有126 個，其中包括本研究得到的ST-1348（分離株3L4）、ST-1349（分離株3L33）、ST-1350（分離株3L47）、ST-1351（分離株1Y55、5L45、1Y58）4 個基因型，使用n-4的BURST將我國不同來源B. cereus分離株的ST型分為10 個組和12 個獨株。Group 1是以ST-26為祖先克隆的主體群屬（72.2%，91/126），Vassileva等[7]研究發(fā)現(xiàn)ST-26為典型的產(chǎn)嘔吐毒素的基因型，此基因型與本研究得到的ST型無重疊，驗證了本實驗2.1節(jié)的初步推斷。ST-1048與ST-1348同屬Group 5，均為ST-23的克隆復合物，其分離株的來源均為中國乳制品，后者采自陜西省嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)鏈的濃縮車間，Barker等[30]探究了臨床分離株的致病性與MLST的關系，研究發(fā)現(xiàn)誘發(fā)菌血癥的B. cereus分離株的ST型與B. thuringiensis的ST型具有同源性，本研究得到的MLST CC 23是B. thuringiensis的ST-23，其分離株3L4（濃縮車間平皿沉降樣）有可能是誘發(fā)菌血癥的菌株；ST-1140和ST-1350同屬Group 7，其分離株來源均為陜西省土壤樣，后者采自陜西省羊乳粉生產(chǎn)工廠周邊的土壤；ST-1227、ST-1311、ST-1351同屬Group 10，其分離株來源分別為食品包裝、陜西省土壤樣、嬰幼兒羊乳粉生產(chǎn)鏈分離株；ST-1349是獨株，其分離株3L33采自嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)鏈的上粉器內壁。

表2 嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)鏈B. cereus分離株ST型的同源關系[28]Table2 Evolutionary relationships of STs for B. cereus strains isolated from goat milk infant formula processing plants

用BURST（n-4）比對了全世界B. cereus分離株，得到27 個組和33 個獨株，進一步分析本研究所得的所有基因型的同源關系，如表2所示。ST-1000、ST-1084、ST-770、ST-1351同屬以ST-142為祖先克隆Group 1，其中ST-1084從屬以ST-205為首的亞克隆復合物；ST-1348從屬以ST-56為祖先克隆的Group 4（圖5）；ST-1349與ST-57、ST-76同屬Group 7。

圖5 ST-1348的進化關系及其所屬Group 4的2 個亞克隆復合物Fig.5 Evolutional relationship of STs in Group4 isolated from different sources around the world and its2 sub-clonal complexes

3 結 論

嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)的B. cereus分離株共分為7 個ST型，分別為ST-770（4.8%，2/42）、ST-1000（71.4%，30/42）、ST-1084（9.5%，4/42）、ST-1348（2.4%，1/42）、ST-1349（2.4%，1/42）、ST-1350（2.4%，1/42）和ST-1351（7.1%，3/42），其中ST-1000是嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)分離株的主要ST型；發(fā)現(xiàn)了4 個新的ST型和4 個新的等位基因，上傳至PubMLST Database得到新的序列號和等位基因號，分別是ST-1348、ST-1349、ST-1350、ST-1351和glp-253、glp-254、ilv-277、pyc-199。嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)B. cereus分離株的基因具有多樣性；嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)環(huán)節(jié)分離株的ST型被識別為205、142、23三個不同克隆譜系，2 個單態(tài)群（ST-770和ST-1351）和2 個獨株（ST-1348和ST-1349），其祖先克隆復合物為142，沒有得到典型致嘔吐基因型ST-26或其同源克隆復合物，而可能引起菌血癥的基因型ST-1348在濃縮車間的空氣樣中檢出。新的ST-1349、ST-1350無祖先克隆復合物，表現(xiàn)出進化變異。