趙秀麗，張毓秀，孫月芹，侯麗華*

（天津科技大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津 300457）

在醬油發(fā)酵過程中，很多醇類、酯類、揮發(fā)性酚和呋喃酮等香味化合物是由耐鹽酵母產(chǎn)生[1-4]。例如S酵母（Zygosaccharomyces rouxii）[5]主要產(chǎn)生乙醇和呋喃酮如5-甲基-2-乙基-4-羥基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxyl-2(or5)-ethyl-5(or2)-methyl-3(2H)-furanone，HEMF）[6]，T酵母（Candida versatilis）主要產(chǎn)生揮發(fā)性酚如4-乙基愈創(chuàng)木酚（4-ethylguaiacol，4-EG）和4-乙基苯酚（4-ethylphenol，4-EP）[7]。T酵母作為醬油發(fā)酵的主要菌株之一，具有復(fù)雜的耐鹽系統(tǒng)，使其在高鹽發(fā)酵環(huán)境中保持正常的生理活動和新陳代謝，該功能豐富了醬油的風(fēng)味物質(zhì)，提高了醬油生產(chǎn)質(zhì)量[3,8]。

SPT15[9-11]為酵母細(xì)胞中基本的常規(guī)轉(zhuǎn)錄因子，具有編碼TATA結(jié)合蛋白（TATA binding protein，TBP）功能[12-14]。TBP是通過RNA聚合酶I、RNA聚合酶II[15]或RNA聚合酶III指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄時所必需的成分[10,16]，而且作為聚合酶I的核心因子、TFIID和TFIIIB的組分，在釋放RNA聚合酶I、RNA聚合酶II或RNA聚合酶III到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)時起著重要的作用[17-19]。目前有研究表明SPT15的突變可以影響乙醇的發(fā)酵[20]。

易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)[21-23]是指一種容易使DNA在復(fù)制擴(kuò)增過程中出現(xiàn)錯誤配對的PCR技術(shù)，又稱錯配PCR或傾向錯誤PCR。一般是利用Taq DNA聚合酶的低保真性和一些PCR體系中的條件[20,24]，降低DNA復(fù)制的保真度，增加堿基在新的DNA鏈合成過程中的錯配率，主要目的在于使得擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)數(shù)量較多的點(diǎn)突變。在實(shí)驗(yàn)過程中降低DNA聚合酶保真性的方法主要有改變PCR溫度、提高M(jìn)g2+濃度、4 種不同dNTP濃度或者改變4 種dNTP的比例、在PCR體系中添加Mn2+等[25-26]。本實(shí)驗(yàn)主要通過提高M(jìn)g2+濃度和改變4 種dNTP比例進(jìn)行易錯PCR。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：T酵母、W303菌株（尿嘧啶缺陷型菌株）、WM2菌株（尿嘧啶缺陷型菌株）和大腸桿菌均為本實(shí)驗(yàn)室保藏；W303+G、WM2+G為含質(zhì)粒的尿嘧啶缺陷型酵母菌株。

質(zhì)粒：YEplac195為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

試劑：YPD培養(yǎng)基（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖；制備固體培養(yǎng)基時加入2%瓊脂粉）；尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基又叫CM-URA培養(yǎng)基（0.8% Ura Minus Media Droupout，2%葡萄糖，2%瓊脂，調(diào)節(jié)pH 7.5，115 ℃滅菌20 min）；Taq DNA聚合酶、dNTP 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RJ-362 PCR擴(kuò)增儀、CFX-348凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī) 美瑞泰克科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴(kuò)增

通過酵母染色體DNA的快速分離[27]得到T酵母DNA。以酵母DNA為模板，分別以ZrURA3-P-up：5’-GC GAGCTCTCGGAATAGCTTTAATGGTG-3’，ZrURA3-P-dn：5’-GCGGTACCACCGATGGGAAATGACTCTT-3’（400 bp）；ZrURA3-T-up：5’-GCGCATGCGGAAGG AATTGAACCATATA-3’，ZrURA3-T-dn：5’-GCAAGC TTGTTTAAGGAATCCATCTTTA-3’（200 bp）為引物分別進(jìn)行正常PCR，得到spt15基因表達(dá)的啟動子和終止子。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 30 min，循環(huán)30 次；72 ℃2 min；4 ℃保存。PCR體系（50 μL）為：10×Buffer5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTP（1∶1∶1∶1）4 μL，上引物1 μL，下引物1 μL，DNA 模板0.5 μg，Taq聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，無菌水35.2 μL。

1.3.2 易錯PCR擴(kuò)增

易錯PCR擴(kuò)增條件為：分別改變反應(yīng)體系中Mg2+濃度和dNTP中dATP、dTTP、dCTP、dGTP比例，以T酵母DNA為模板，以ZrSPT15-up：5’-GCGTCGACATGGCTG ACGAGGGACGTTT-3’，ZrSPT15-dn：5’-GCCTGCAGC TACATTTTCCTGAATTCAC-3’（720 bp）為引物。反應(yīng)結(jié)束收集反應(yīng)產(chǎn)物。

1.3.3 酶切、連接反應(yīng)

啟動子用限制性內(nèi)切酶KpnI和SacI、終止子用限制性內(nèi)切酶SphI和HindIII雙酶切[27]后，經(jīng)DNA連接酶與載體質(zhì)粒YEplac195連接[20]，構(gòu)建成YEplac195-P-T。將spt15基因突變庫中的基因和YEplac195-P-T用限制性內(nèi)切酶SalI和PstI進(jìn)行雙酶切，并經(jīng)DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到Y(jié)Eplac195-P-T-spt15基因突變質(zhì)粒庫。

1.3.4 酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選

采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法[27-28]將YEplac195-P-T-spt15質(zhì)粒導(dǎo)入W303和WM2菌株中，用CM-URA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。將培養(yǎng)基中長出的單菌落用無菌牙簽分別在含2% NaCl CM-URA培養(yǎng)基、4% NaCl CM-URA培養(yǎng)基和6% NaCl CM-URA培養(yǎng)基中對長出的菌落進(jìn)行點(diǎn)接，每個培養(yǎng)皿中的菌株一一對應(yīng)、排列整齊，并給每對培養(yǎng)基編號，并做Dilution驗(yàn)證。

1.3.5 Dilution實(shí)驗(yàn)

取培養(yǎng)過夜的菌液測OD值，根據(jù)OD值取菌數(shù)量相同得菌液量進(jìn)行離心，之后用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，一般稀釋5 個濃度梯度。稀釋之后取1 μL在平板中相同梯度的菌液一一對應(yīng)進(jìn)行點(diǎn)接。

1.3.6 醬油氨基酸態(tài)氮的測定

對耐鹽性好的WM2酵母進(jìn)行低鹽固態(tài)發(fā)酵[29]，用雙指示劑甲醛滴定法[30]對醬油中氨基酸態(tài)氮進(jìn)行簡單測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 易錯PCR體系建立及spt15基因突變庫的構(gòu)建

2.1.1 改變Mg2+濃度

普通PCR體系中的MgCl2（溶液原始濃度25 mmol/L）的終濃度一般為1 mmol/L左右。本實(shí)驗(yàn)將MgCl2終濃度設(shè)置成1 mmol/L以上，經(jīng)易錯PCR后，瓊脂糖凝膠電泳見圖1。

圖1 不同MgCl2添加量PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR products with different amounts of MgCl2 addition

MgCl2濃度2.0～2.7 mmol/L之間的電泳條帶比較明亮，隨著MgCl2濃度的不斷增加，所得電泳條帶又開始變暗。為得到較多的易錯PCR產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)以MgCl2濃度2.0～2.7 mmol/L為條件重復(fù)3 次易錯PCR實(shí)驗(yàn)，將所得的PCR產(chǎn)物全部收集，并進(jìn)行純化，共得到3 管易錯PCR產(chǎn)物。

2.1.2 改變4 種dNTP的添加比例

圖2 改變不同堿基添加量所得電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of PCR product with different amounts of dNTP addition

普通PCR體系中4 種堿基（dATP-dTTP-dCTP-dGTP）比例為1∶1∶1∶1。在進(jìn)行易錯PCR時，每次改變體系中4 種堿基（dATP-dTTP-dCTP-dGTP）其中一種堿基的添加量其他3 種保持不變，以得到不同的比例。瓊脂糖凝膠電泳后見圖2。

從圖2可以看出，dATP-dTTP-dCTP-dGTP中改變dATP時比例在1∶1∶1∶1～3.6∶1∶1∶1之間的電泳條帶較亮，之后的電泳條帶較暗。改變dTTP時比例在1∶1∶1∶1～1∶4.0∶1∶1之間時電泳條帶比較明亮，之后條帶比較暗。改變堿基dCTP量所得PCR產(chǎn)物的電泳條帶總體不亮。改變堿基dGTP的量所得到的電泳圖像總體明亮，即使堿基dATP-dTTP-dCTP-dGTP比例在1∶1∶1∶4.0時仍有很亮條帶。本實(shí)驗(yàn)在電泳條帶較亮的范圍進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，收集產(chǎn)物。主要以dATP-dTTP-dCTP-dGTP比例在1∶1∶1∶1～3.6∶1∶1∶1、1∶1∶1∶1～1∶4.0∶1∶1、1∶1∶1∶1～1∶1∶4.0∶1、1∶1∶1∶1～1∶1∶1∶4.4之間進(jìn)行PCR產(chǎn)物的收集，共收集12 管。

在Mg2+濃度和4 種堿基dATP-dTTP-dCTP-dGTP不同比例這幾個方面進(jìn)行易錯PCR，并且分別進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行收集、純化，共得到15 管易錯PCR產(chǎn)物，所收集的易錯PCR產(chǎn)物為spt15基因突變庫。

2.1.3 spt15基因突變質(zhì)粒庫的構(gòu)建

將經(jīng)KpnI和SacI雙酶切后切膠回收的啟動子和載體YEplac195片段進(jìn)行連接，得到Y(jié)Eplac195-P。經(jīng)SphI和HindIII雙酶切后的終止子和載體YEplac195-P進(jìn)行連接，得到Y(jié)Eplac195-P-T。將SalI和PstI雙酶切的spt15切膠回收得到基因片段與YEplac195-P-T用DNA連接酶進(jìn)行連接，得到Y(jié)Eplac195-P-T-spt15，如圖3所示。

圖3 重組質(zhì)粒YEplac195-P-T-spt15Fig.3 Recombinant plasmid pattern of YEplac195-P-T-spt15

在spt15基因突變質(zhì)粒庫的構(gòu)建過程中，得到一個既含有YEplac195-P-T-spt15重組體、YEplac195-P-T片段自連重組體，也含有游離spt15片段和YEplac195-P-T片段的混合體系。將混合體導(dǎo)入大腸桿菌中，YEplac195-P-T-spt15重組體，YEplac195-P-T片段自連重組體會在LBA平板上生長，隨機(jī)挑取18 個單菌落，編號完整，搖瓶過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切篩選。

圖4 重組質(zhì)粒YEplac195-P-T-spt15雙酶切電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of double enzyme digestion of recombinant plasmid YEplac195-P-T-spt15

從圖4可知，雙酶切后出現(xiàn)720 bp條帶的為已成功連接spt15基因片段的YEplac195-P-T質(zhì)粒，可以計算出連接spt15基因片段的效率在50%左右，證明連接基因片段的方法可行性較好，對于連接的片段是否為所需要的目的基因片段還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

2.2 優(yōu)勢菌株的篩選

2.2.1 W303+G菌株篩選

本實(shí)驗(yàn)將所收集的YEplac195-P-T-spt15重組體導(dǎo)入W303[24-25]，涂布在尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，待長出白色菌落后，隨機(jī)挑取長勢良好的菌落劃線轉(zhuǎn)接到含2% NaCl的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型平板上，放于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d，待長出菌落后，繼續(xù)挑取長勢旺盛的菌落劃線轉(zhuǎn)接到含4% NaCl的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型平板上，經(jīng)培養(yǎng)繼續(xù)劃線轉(zhuǎn)接到6% NaCl的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型平板上。W303酵母生長情況見圖5。

既往研究認(rèn)為，JME難以治愈，即使癲癇長時間內(nèi)得到控制，絕大多數(shù)病人也需要終生服藥。近年來有些長期隨訪研究提示，在一些JME患者中，并不需要終身服用抗癲癇藥物，停藥數(shù)年后仍可保持發(fā)作終止，預(yù)后良好，有望治愈[28-29]。JME預(yù)后與發(fā)作類型、確診時間、用藥情況、腦電圖表現(xiàn)等諸多因素有關(guān)，早期正確診斷，特別是趕在GCTS出現(xiàn)之前給予及時合理治療，預(yù)后會更好，因此，更多的臨床醫(yī)生加強(qiáng)對此病的認(rèn)識和判斷，非常有意義。

圖5 篩選耐鹽酵母的過程Fig.5 Screening of salt-tolerant yeast

從圖5可以看出，在含2% NaCl的平板中W303+G菌株長勢都很好，經(jīng)梯度增加NaCl后，在含6% NaCl的平板中只有少數(shù)W303+G菌株生長較好。在含6% NaCl的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型平板上隨機(jī)挑取長勢旺盛的4 個單菌落，分別命名為A1、A2、A3、A4。進(jìn)行尿嘧啶缺陷型液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒a1、a2、a3、a4，導(dǎo)入WM2中，進(jìn)行過夜培養(yǎng)，測OD值，取相同數(shù)量的菌體進(jìn)行Dilution實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 WM2+G菌株Dilution實(shí)驗(yàn)

將a0（不含spt15基因的質(zhì)粒）、a1、a2、a3、a4質(zhì)粒導(dǎo)入WM2菌株，在不同鹽濃度的尿嘧啶缺陷型平板上做Dilution實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 WM2G菌株梯度稀釋結(jié)果圖Fig.6 Gradient ddilution of WM2 + G

從圖6可以看出，在相同菌個數(shù)的情況下，導(dǎo)入a1、a2、a3、a4質(zhì)粒的菌株比導(dǎo)入a0的菌株生長狀況要好，可以判斷含突變基因的菌株在耐鹽方面比對照菌株要好。

2.2.3 PCR后測序驗(yàn)證

將得到的a1、a2、a3、a4質(zhì)粒進(jìn)行PCR，看是否有目的條帶，并將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。將重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物送至測序公司。測序結(jié)果使用DNAMAN對測序結(jié)果和目的基因序列進(jìn)行比對見圖7。

從圖7可以看出，構(gòu)建后的重組質(zhì)粒a1、a2、a3和a4中目的基因的序列有堿基的增添、缺失、替換等突變的出現(xiàn)。通過統(tǒng)計分析，在所有突變的堿基中，可得A、G互換的頻率較高，其中A、G互換率為28.9%，A、T互換率為19.3%，C、T互換率為24.7%，其他突變率為11.5%。

2.2.4 醬油發(fā)酵

將所得的4 個質(zhì)粒導(dǎo)入本實(shí)驗(yàn)室誘變所得的WM2菌株中得WM2+G，在低鹽固態(tài)醬油的發(fā)酵過程中加入WM2+G菌株，待發(fā)酵成熟后測定氨基酸態(tài)氮的含量，所得結(jié)果見圖8。

圖7 重組質(zhì)粒表達(dá)載體的測序結(jié)果Fig.7 Sequencing results of the expression vectors

圖8 氨基酸態(tài)氮的測量結(jié)果Fig.8 Amino nitrogen contents of soy sauces fermented by four mutants

由圖8可以看出，a0、a1、a2、a3、a4的氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度分別為0.8、0.92、0.90、0.86、0.90 g/100 mL。含a1、a2、a3、a4質(zhì)粒的WM2+G菌株比含a0（不含spt15的YEPlac195質(zhì)粒）的WM2+G菌株在發(fā)酵醬油的過程中能產(chǎn)生更多的氨基酸態(tài)氮，經(jīng)數(shù)據(jù)分析可得出，含a1、a2、a3、a4質(zhì)粒的菌較含a0的菌在發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的增加率分別為15%、12.5%、7.5%、12.5%?？芍Y選的菌株能夠在鹽濃度高的環(huán)境中更好地降解蛋白質(zhì)，得到更多的氨基酸態(tài)氮。這對于高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵是有利的，同時也可知通過易錯PCR隨機(jī)誘變的方法可以得到有利于醬油發(fā)酵的突變基因。

3 結(jié) 論

分別在Mg2+濃度和4 種堿基dATP-dTTP-dCTP-dGTP不同比例這兩個方面進(jìn)行易錯PCR，并且分別進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行收集、純化，共得到18 管易錯PCR產(chǎn)物，所收集的易錯PCR產(chǎn)物為spt15基因突變庫。從所得到的spt15基因突變庫中取部分突變基因，經(jīng)重組體構(gòu)建，導(dǎo)入W303菌株，尿嘧啶缺陷型平板的篩選，選出了4 個耐鹽性較好的菌株A1、A2、A3、A4，并提取出質(zhì)粒a1、a2、a3、a4。

將得到的4 個重組質(zhì)粒a1、a2、a3、a4導(dǎo)入本實(shí)驗(yàn)室誘變的尿嘧啶缺陷型菌株WM2中，WM2+G經(jīng)Dilution實(shí)驗(yàn)可以看出含4 個質(zhì)粒的酵母菌株在耐鹽方面有一定的優(yōu)勢。在進(jìn)行酵母發(fā)酵中，加入分別含有a0（不含突變基因的質(zhì)粒）、a1、a2、a3、a4質(zhì)粒的WM2+G菌株，經(jīng)過氨基酸態(tài)氮的測定，含a1、a2、a3、a4質(zhì)粒的WM2+G菌株的發(fā)酵液中比含a0質(zhì)粒的WM2+G菌株的發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮的含量要高。關(guān)于所得最佳突變基因會在醬油發(fā)酵中提高氨基酸態(tài)氮含量的原因，其與發(fā)酵環(huán)境的機(jī)理以及在菌株中的發(fā)揮作用的方式等還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究。此菌株還不能直接用于實(shí)際生產(chǎn)，需進(jìn)行多方面的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。