劉東紅，林峰，楊再興，張振成，仲人前，梁艷

（1.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬黃巖醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 臺(tái)州 318020；2.臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬黃巖醫(yī)院 普外科，浙江 臺(tái)州 318020；3.上海長(zhǎng)征醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)診斷科，上海200003）

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種慢性、膽汁淤積性、自身免疫性肝病，其病理學(xué)特征是肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（intrahepatic biliary epithelial cell，IBEC）的炎癥損傷，但病因和發(fā)病機(jī)制未明。研究表明泌尿道感染與PBC密切相關(guān)[1]，泌尿道感染主要由革蘭氏陰性菌引起，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是其細(xì)胞壁主要成分，LPS也是Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）的天然配體，因此，我們推測(cè)TLR4通路的異常活化可能在PBC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，且TLR4在PBC患者外周血和肝組織中的表達(dá)均明顯上調(diào)，提示PBC中確實(shí)存在TLR4通路異常[2-4]。但TLR4與PBC的IBEC損傷的關(guān)系國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一種上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，在腫瘤轉(zhuǎn)移和纖維化疾病中起重要作用。研究顯示，膽管細(xì)胞在TGF-β等細(xì)胞因子刺激下會(huì)發(fā)生EMT，可能促進(jìn)先天性膽道閉鎖等膽汁淤積性肝病肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[5]。而且，在PBC患者肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的肝組織中也發(fā)現(xiàn)了膽管細(xì)胞的EMT[6]。這些結(jié)果提示，PBC患者IBEC有發(fā)生EMT的可能，從而有助于PBC從炎癥向纖維化發(fā)展。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)了PBC肝組織中TLR4和IBEC的EMT標(biāo)志物的表達(dá)情況，并探討了二者的相關(guān)性及與PBC進(jìn)展的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集上海長(zhǎng)征醫(yī)院就診的PBC患者11例（PBC組），男3例，女8例，年齡（48±13）歲，診斷均符合美國(guó)肝病學(xué)會(huì)提出的最新PBC診斷指南，且所有患者均進(jìn)行了肝組織活檢。其中，肝組織學(xué)表現(xiàn)為PBC I期2例， II期3例， III期2例，IV期4例。同時(shí)收集5例肝移植供肝者肝組織切片標(biāo)本作為正常對(duì)照組。其中，男3例，女2例，年齡（50±12）歲，HE染色顯示肝臟無(wú)任何病變。本研究經(jīng)上海長(zhǎng)征醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器 兔抗人TLR4抗體購(gòu)自武漢博士德生物公司；小鼠抗人波形蛋白Vimentin抗體、兔抗人E-鈣黏蛋白即用型抗體、小鼠抗人細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）即用型免疫組織化學(xué)單克隆抗體以及即用型免疫組織化學(xué)Elivision plus試劑盒（鼠/兔）、DAB顯色試劑盒和蘇木素體細(xì)胞快速染液均購(gòu)自福州邁新公司；普通光學(xué)顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色：將常規(guī)4%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋好的肝組織塊制成厚3 μm的切片。采用鏈霉素-過(guò)氧化物酶免疫組織化學(xué)方法染色，其中TLR4一抗按1:100稀釋，其他抗體為即用型。采用DAB液顯色。

1.3.2 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)：在顯微鏡下觀察切片，對(duì)每例切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，以IBEC出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，特異性分布于胞漿或胞膜者為陽(yáng)性，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。公式為：陽(yáng)性表達(dá)率＝陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)/IBEC數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。各組間陽(yáng)性表達(dá)率比較采用χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用χ2分割法，多組小樣本量的計(jì)量資料的比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，各標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)率之間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CK19在PBC患者肝組織中的表達(dá) CK19在正常對(duì)照組及PBC組IBEC中均有表達(dá)，且陽(yáng)性率隨著PBC分期增高而明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 TLR4在PBC患者IBEC中的表達(dá) TLR4蛋白在正常對(duì)照組IBEC中幾乎無(wú)表達(dá)，在PBC組IBEC胞膜上表達(dá)，各期PBC患者TLR4表達(dá)平均陽(yáng)性率分別為I期28.6%、 II期41.6%、 III期64.1%、IV期73.1%。兩兩比較的結(jié)果顯示，除I期與 II期及 III期與IV期外，其余各組間陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

2.3 上皮細(xì)胞標(biāo)志E-鈣黏蛋白在PBC患者IBEC中的表達(dá) E-鈣黏蛋白在正常對(duì)照組IBEC胞膜和胞漿中表達(dá)，而在PBC組IBEC中表達(dá)明顯降低，各期PBC患者E-鈣黏蛋白平均陽(yáng)性率分別為I期84.0%、 II期48.1%、II 期23.0%、IV期19.0%，兩兩比較結(jié)果顯示，除正常對(duì)照組與I期及 III期與IV期外，其余各組間陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖1 肝組織門管區(qū)CK19表達(dá)

圖2 肝組織中TLR4表達(dá)情況

圖3 肝組織E-鈣黏蛋白表達(dá)

2.4 Vimentin在PBC患者IBEC中的表達(dá) Vimentin在正常對(duì)照組IBEC幾乎無(wú)表達(dá)，在PBC組IBEC胞漿表達(dá)明顯，各期Vimentin平均陽(yáng)性率分別為I期30.0%、 II期40.1%、 III期73.7%、IV期77.0%。兩兩比較結(jié)果顯示，除I期與II期以及III期與IV期外，其余各組間陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 肝組織Vimentin表達(dá)

2.5 PBC患者IBEC TLR4陽(yáng)性表達(dá)率與EMT相關(guān)蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的相關(guān)性 PBC患者IBEC TLR4表達(dá)與E-鈣黏蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.927，P＜0.001），與Vimentin呈顯著正相關(guān)（r=0.918，P＜0.001），E-鈣黏蛋白表達(dá)與Vimentin呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.918，P＜0.001），見(jiàn)圖5。

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)TLR4在PBC患者外周血[7]和肝組織中的表達(dá)明顯上調(diào)[2-4]，而且TLR4通路在PBC中是異?；罨腫8-9]。本研究也發(fā)現(xiàn)TLR4在PBC患者肝組織IBEC中的表達(dá)顯著上調(diào)，且其表達(dá)隨PBC纖維化、硬化程度加重而顯著增加。這提示TLR4的異常升高可能參與了PBC由炎癥向纖維化、硬化發(fā)展的過(guò)程。但TLR4參與PBC由炎癥向纖維化、硬化發(fā)展的具體機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

PBC的發(fā)展過(guò)程通常是一種由慢性炎癥向纖維化、硬化逐漸過(guò)渡的緩慢進(jìn)程。在此過(guò)程中，IBEC逐漸減少。但I(xiàn)BEC減少的原因以及這種減少與PBC由炎癥向纖維化發(fā)展有何關(guān)系，尚不完全清楚。在先天性膽管閉鎖等膽汁淤積性肝病以及膽管結(jié)扎術(shù)大鼠中的IBEC存在EMT現(xiàn)象[5]。而且，在PBC患者肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)的肝組織中也發(fā)現(xiàn)IBEC的EMT現(xiàn)象[6]。本研究進(jìn)一步證實(shí)，PBC的IBEC確實(shí)發(fā)生了EMT，即IBEC由上皮細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞甚至成纖維細(xì)胞，而且，EMT隨著PBC纖維化、硬化的加重而愈發(fā)明顯。這些結(jié)果提示，PBC中由于IBEC發(fā)生EMT而使自身逐漸減少，同時(shí)有助于PBC由炎癥向纖維化、硬化發(fā)展。

圖5 PBC患者IBEC EMT相關(guān)標(biāo)志物的相關(guān)性

本研究結(jié)果還表明，PBC患者IBEC中TLR4的表達(dá)與IBEC發(fā)生EMT密切相關(guān)。已有文獻(xiàn)報(bào)道TLR4信號(hào)通路活化可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞[10]、肝癌細(xì)胞[11]、胃癌細(xì)胞[12]等多種細(xì)胞發(fā)生EMT。綜合這些結(jié)果，可以推測(cè)，在PBC中，IBEC的TLR4通路異常活化，有助于誘導(dǎo)IBEC發(fā)生EMT，從而出現(xiàn)了IBEC的持續(xù)減少直至消失。也正是由于IBEC通過(guò)EMT向間質(zhì)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，引起了PBC由炎癥向纖維化、硬化發(fā)展。但這一推測(cè)還有待于進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。