周玉平，呂雪幼，璩輝，朱林文，葉國良，郭俊明

（1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 寧波 315020；2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所 浙江省病理生理學(xué)技術(shù)研究重點實驗室，浙江 寧波 315211）

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是近年來非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）領(lǐng)域最新的研究熱點。circRNA是一類通過特殊剪切產(chǎn)生的ncRNA分子，大量存在于真核細胞，具有一定的組織、時序、疾病特異性，在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]。circRNA對肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是否具有調(diào)控作用目前尚不明確。因此，本研究采用circRNA芯片技術(shù)分析肝纖維化模型肝組織的circRNA表達譜，并用生物信息學(xué)方法分析差異表達circRNA的可能生物學(xué)功能，以期從circRNA角度解析肝纖維化的發(fā)病機制，為肝纖維化研究提供新的方向和思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量為（20±2）g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)及實驗在寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心進行，并獲得寧波大學(xué)動物倫理委員會批準同意。

1.1.2 主要試劑和儀器：四氯化碳（CCl4）分析純（上海國藥集團），橄欖油化學(xué)純（上海國藥集團），蘇木精（美國Sigma公司），麗春紅（美國Sigma公司），苯胺藍（美國Sigma公司），Trizol（美國Invitrogen公司），核酸外切酶RNase R（美國Epicentre公司），ds-cDNA合成試劑盒（美國Invitrogen公司），ds-cDNA標記試劑盒（瑞士NimbleGen公司），2×PCR master mix（美國Arraystar公司），Gene Amp PCR System 9700（美國Applied Biosystems公司），ViiA 7 Real-time PCR System（美國Applied Bio

systems公司），Mouse circular RNA Array V2.0芯片（美國Arraystar公司），分子雜交儀（美國Agilent公司），Scanner G2505C芯片掃描儀（美國Agilent公司）。小鼠PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 動物造模和肝組織采集：實驗小鼠隨機分為正常對照組、模型組，每組各8只。模型組按體質(zhì)量以15% CCl4-橄欖油溶液2 mL/kg，腹腔注射，每周3次，正常對照組不處理，5周末采集小鼠肝臟組織。先用3%戊巴比妥鈉以5 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠，打開腹腔，觀察肝脾大體形態(tài)，經(jīng)下腔靜脈采血，迅速切取肝臟最大葉，放入4%多聚甲醛中固定用于石蠟切片組織學(xué)觀察；其余肝葉投入液氮中速凍，轉(zhuǎn)入-80 ℃長期保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 PCR所用引物序列

1.2.2 組織病理學(xué)觀察：常規(guī)制備肝組織石蠟切片行HE染色和Masson染色，觀察組織炎癥和膠原增生情況。Masson染色后光學(xué)顯微鏡下可見膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色，細胞核成藍褐色。組織切片由2位病理專家盲法進行閱片。

1.2.3 ds-cDNA合成、標記與雜交：cicrRNA芯片分析由上?？党缮镉邢薰就瓿?。正常對照組和模型組小鼠隨機取3例，分別提取肝組織總RNA，先用RNase R消化總RNA，去除線性RNA，富集circRNA，將富集的circRNA采用隨機引物轉(zhuǎn)錄，擴增為熒光標記的cRNA探針，cRNA探針與Arraystar Mouse circRNA Arrays V2（8x15K）芯片進行雜交。

1.2.4 cicrRNA芯片數(shù)據(jù)分析：采用Agilent Scanner G2505C掃描芯片，Agilent Feature Extraction software（version 11.0.1.1）軟件分析結(jié)果。2組樣本間差異表達的circRNA通過變化倍數(shù)和P值進行篩選，將變化倍數(shù)＞2倍，P＜0.05視為差異表達。將篩選出的差異circRNA繪制散點圖，并對所得數(shù)據(jù)進行監(jiān)督性層次聚類分析。每條circRNA均用美國Arraystar公司的微小RNA（microRNA，miRNA）結(jié)合位點預(yù)測軟件mirTarget預(yù)測5個高匹配值的miRNA結(jié)合位點。

1.2.5 RT-qPCR：Trizol法提取肝組織樣本總RNA，并測定RNA的純度和濃度，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA模板，將master mix預(yù)混液、模板、上/下游引物、ddH2O配制成PCR反應(yīng)溶液，進行PCR擴增反應(yīng)，設(shè)置參數(shù)如下：95 ℃ 10 min預(yù)變性；40個PCR循環(huán)（95 ℃ 10 s；60 ℃ 60 s）。以GAPDH為管家基因，標準曲線法計算目的基因的相對表達量。每個樣本重復(fù)3次實驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進行分析。數(shù)據(jù)以±s表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠肝組織病理學(xué)觀察 HE染色顯示，正常對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索由中央靜脈向四周放射排列，中央靜脈、匯管區(qū)動靜脈和膽管結(jié)構(gòu)正常；模型組肝細胞廣泛壞死，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，可見大量的炎性細胞浸潤。Masson染色顯示：正常對照組小鼠僅在匯管區(qū)和中央靜脈見少量膠原纖維；模型組肝組織膠原廣泛增生，由匯管區(qū)向四周放射延伸，部分形成大小不一的完整假小葉結(jié)構(gòu)。見圖1。

圖1 2組小鼠肝組織HE染色（×200）和Masson染色（×100）結(jié)果

2.2 cicrRNA芯片篩查結(jié)果 cicrRNA芯片篩查結(jié)果顯示，共檢測到10 389個cicrRNA，與正常對照組相比，模型組肝組織差異表達的circRNA共有69個，其中上調(diào)2倍以上的有14個，下調(diào)2倍以上的有55個；上調(diào)4倍以上的有1個，下調(diào)4倍以上的有5個，結(jié)果見表2和圖2A。監(jiān)督性分層聚類分析顯示，差異表達的circRNA能正確區(qū)分模型組和正常對照組，見圖2B。

2.3 差異cicrRNA的RT-qPCR驗證 綜合芯片結(jié)果的差異倍數(shù)高、組內(nèi)樣本一致性好、circRNA類型等因素，選取其中差異倍數(shù)4倍以上，屬于外顯子（exonic）類型的5個circRNA作為目標circRNA，進行RT-qPCR驗證，結(jié)果顯示，5個circRNA變化趨勢與芯片結(jié)果一致，其中4個差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

表2 差異表達4倍以上的circRNA

圖2 利用散點圖和熱圖分析circRNA表達譜變化

2.4 cicrRNA作用的靶miRNA的預(yù)測 運用mirTarget軟件對上述5個cicrRNA進行分析，得到可能與之相互作用的miRNA（見表3）。對這些miRNA進行文獻檢索分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-338-3p[1]、miRNA-141[2-3]與肝纖維化發(fā)生機制有關(guān)。

表3 生物信息學(xué)分析預(yù)測的可能與circRNA相互作用的miRNA

圖3 部分差異circRNA的肝組織RT-qPCR驗證

3 討論

circRNA相關(guān)研究進展迅速，已有的研究證實circRNA的生物學(xué)功能至少包括以下幾個方面：miRNA海綿作用、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控RNA結(jié)合蛋白等[4]。其中，miRNA海綿作用最受關(guān)注，研究表明，外顯子來源的circRNA表面存在miRNA的反應(yīng)元件（microRNA response element，MRE），能特異性結(jié)合miRNA，調(diào)控下游基因的表達[5]。目前對于circRNA與疾病的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域。circRNA與肝臟疾病的研究目前報道不多，已有的研究主要是關(guān)于原發(fā)性肝癌circRNA診斷標志物的發(fā)現(xiàn)[6]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA與非酒精性脂肪肝及肝再生機制有關(guān)[7-8]。circRNA與肝纖維化的相關(guān)研究則鮮有報道。最近，CHEN等[9]報道circRNA與肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）活化有關(guān)，初步探討了circRNA與肝纖維化的關(guān)系。

本研究采用高通量芯片初步研究了經(jīng)典的CCl4肝纖維化小鼠模型肝組織的circRNA的表達譜變化，結(jié)果顯示，部分circRNA在模型組肝組織中表達明顯變化，提示circRNA可能與肝纖維化進展有關(guān)。根據(jù)芯片結(jié)果的差異倍數(shù)高、組內(nèi)樣本一致性好，我們選取部分差異circRNA進一步進行了RT-qPCR驗證和生物信息學(xué)功能預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mmu_circ_42398、mmu_circ_42397、mmu_circ_34116的靶miRNA（包括miR-338-3p、miR-22-3p、miR-141-5p）與肝纖維化發(fā)病機制密切相關(guān)[1-3，10]，本研究結(jié)果提示，circRNA與肝纖維化發(fā)生和發(fā)展過程存在一定關(guān)聯(lián)，circRNA可能通過miRNA分子海綿作用，參與肝纖維化的進展，但還需要進一步驗證。