祁之秋 李修偉 紀(jì)明山

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110161）

灰霉病是近年來(lái)保護(hù)地番茄、黃瓜、草莓等作物上的重要病害，發(fā)生時(shí)間早、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、傳播速度快，一般減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)50%以上（陳茂春，2018）。能否及時(shí)有效地防治灰霉病是番茄生產(chǎn)中的重要問(wèn)題?；瘜W(xué)防治是控制灰霉病的主要手段，但隨之帶來(lái)的抗藥性、再猖獗、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問(wèn)題越來(lái)越引起人們的關(guān)注。從植物中尋找活性物質(zhì)是開發(fā)新農(nóng)藥的重要方法，植物源農(nóng)藥也成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一（張興等，2015）。胡椒科植物蓽茇、黑胡椒、白胡椒等是中蒙藏醫(yī)常用藥物（呼日樂巴根，2009）。本文測(cè)定了蓽茇、假蒟、黑胡椒、白胡椒4種胡椒科植物粗提物對(duì)灰葡萄孢的抑菌活性，旨在為植物源抑菌農(nóng)藥新資源的尋找和發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病原菌：灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers），由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

供試植物：蓽茇（Piper longum L.）、假蒟（Piper sarmentosum Roxb.）、黑胡椒（black pepper）及白胡椒（white pepper），購(gòu)于中藥材市場(chǎng)。

化學(xué)藥劑：98.2%嘧霉胺（pyrimethanil）原藥購(gòu)于昆山瑞澤農(nóng)藥股份有限公司，稱取0.105 1 g原藥，用丙酮定容到10 mL，配得10 000 mg·L-1母液，作為藥劑對(duì)照。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物粗提物的提取 分別將4種供試植物粉碎，過(guò)60目篩；稱取500 g（DW），用95%乙醇提取3次，加入的乙醇量分別為400、200、200 mL，每次提取48 h，合并萃取濾液；50 ℃減壓濃縮得粗浸膏物，以乙醇為溶劑，配成1 g·mL-1活性物質(zhì)提取物。

1.2.2 植物粗提物對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)的影響 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定植物粗提物對(duì)灰葡萄孢的抑制作用。用乙醇將植物粗提物與PDA培養(yǎng)基混合，配制成濃度為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1的含藥培養(yǎng)基，每個(gè)處理均以只加入乙醇的培養(yǎng)基為對(duì)照（CK0）。將嘧霉胺與PDA培養(yǎng)基混勻，制成最終濃度為128、32、8、2、1 μg·mL-1的含藥平板，作為對(duì)照藥劑（CK1）。每處理3次重復(fù)。將直徑5 mm的灰葡萄孢菌餅接種于平板中央，25 ℃下培養(yǎng)4 d。測(cè)量菌落直徑，求得每種植物提取物對(duì)灰葡萄孢的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和EC50。

1.2.3 植物粗提物對(duì)灰葡萄孢產(chǎn)孢量的影響 按照1.2.2的方法，配制植物粗提物及對(duì)照藥劑的含藥培養(yǎng)基，各處理濃度均設(shè)定為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1，接種灰葡萄孢菌餅。將接種后的培養(yǎng)皿放入25 ℃恒溫箱，培養(yǎng)至產(chǎn)孢（約25 d）。每平板距菌落邊緣相等處挑取5個(gè)菌碟（φ=1 cm）放入空滅菌離心管中，加入2 mL無(wú)菌水，振蕩沖洗1 min。在40倍顯微鏡下，利用血球計(jì)數(shù)板記錄孢子數(shù)，每處理4次重復(fù)（Rod ír gueza et al.，2011）。

1.2.4 植物粗提物對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響 取PDA平板上已產(chǎn)孢的灰葡萄孢菌，用無(wú)菌水配制孢子懸浮液（1×104個(gè)·mL-1），取20 μL滴在凹玻片上，再分別滴加20 μL不同稀釋倍數(shù)的植物粗提液和對(duì)照藥劑，使每處理濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1?；靹蚝笾糜?5 ℃下培養(yǎng)12 h，以只加入乙醇的培養(yǎng)基為對(duì)照（CK0），每處理4次重復(fù)，在顯微鏡下觀察并記錄萌發(fā)孢子數(shù)，計(jì)算不同濃度植物粗提物對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制率。

1.2.5 植物粗提物對(duì)灰葡萄孢菌核產(chǎn)生的影響 按1.2.2的方法將灰葡萄孢接入含系列濃度粗提物的PDA平板中，25 ℃下培養(yǎng)25 d，觀察在不同濃度的4種植物粗提物PDA平板上是否有菌核產(chǎn)生。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物粗提物對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)的影響

胡椒科4種植物對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)均有較強(qiáng)的抑制作用。當(dāng)各處理濃度為0.5 g·mL-1時(shí)，蓽茇提取物對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)的抑制率最高，達(dá)到91.8%，其次是白胡椒和黑胡椒提取物，分別達(dá)到86.4%和50.8%，假蒟提取物的抑制率僅為36.8%。從表1中可以看出，蓽茇、假蒟、黑胡椒和白胡椒對(duì)灰葡萄孢的EC50分別為0.032 2、0.883 2、0.398 0、0.007 9 g·mL-1。但 4種胡椒科植物粗提物對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)的抑制作用明顯低于嘧霉胺。

表1 植物粗提物對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

2.2 植物粗提物對(duì)灰葡萄孢產(chǎn)孢量的影響

相同濃度下，蓽茇、假蒟粗提物對(duì)灰葡萄孢產(chǎn)孢量的抑制作用較強(qiáng)，其次為白胡椒，黑胡椒抑制作用較低（表2）。當(dāng)濃度為0.5 g·mL-1時(shí)，蓽茇、假蒟和白胡椒粗提物對(duì)灰葡萄孢產(chǎn)孢量的抑制率分別為92.8%、92.0%和82.8%，而黑胡椒粗提物的抑制率僅達(dá)58.8%；當(dāng)濃度為0.062 5 g·mL-1時(shí)，蓽茇和假蒟對(duì)灰葡萄孢產(chǎn)孢量的抑制作用仍達(dá)60%以上。但植物粗提物對(duì)灰葡萄孢產(chǎn)孢量的抑制作用遠(yuǎn)小于化學(xué)藥劑嘧霉胺。

表2 植物粗提物對(duì)灰葡萄孢產(chǎn)孢量的影響

2.3 植物粗提物對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響

4種植物粗提物對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)有強(qiáng)烈的抑制作用（表3）。相同濃度下，黑胡椒和白胡椒粗提物對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)的抑制作用強(qiáng)于蓽茇和假蒟，當(dāng)濃度為0.031 25 g·mL-1時(shí)，二者對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)的抑制率仍高于65%，而蓽茇和假蒟粗提物對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率不到30%。對(duì)照藥劑嘧霉胺對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)，抑制率在98%以上。

表3 植物粗提物對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響

2.4 植物粗提物對(duì)灰葡萄孢菌核產(chǎn)生的影響

從表4可以看出，除了0.031 25 g·mL-1假蒟粗提物對(duì)灰葡萄孢菌核無(wú)影響外；4種植物粗提物濃度高于0.062 5 g·mL-1時(shí)，均能完全抑制灰葡萄孢菌核的產(chǎn)生。

表4 植物粗提物對(duì)灰葡萄孢菌核產(chǎn)生的影響

3 結(jié)論與討論

植物源活性物質(zhì)的研究已成為當(dāng)前的熱點(diǎn)與趨勢(shì)，并取得了顯著的成果（張興 等，2015）。胡椒科植物多數(shù)具有藥用價(jià)值，其中的活性物質(zhì)研究也受到了廣泛的關(guān)注（孫丹 等，2008；Gulzar et al.，2013）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，胡椒科植物蓽茇、假蒟、黑胡椒和白胡椒的乙醇粗提物對(duì)灰葡萄孢發(fā)育的各階段都有較強(qiáng)的抑制作用。白胡椒乙醇提取物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，EC50為0.007 9 g·mL-1，其次為蓽茇、黑胡椒和假蒟。孫丹等（2008）的研究表明，假蒟和草胡椒的粗提物對(duì)8種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)具有抑菌活性，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。盡管采用乙醇萃取植物中次生代謝產(chǎn)物已有許多報(bào)道（魯世偉 等，2010；閆紅豆 等，2014；陳楚英等，2016），但因溶劑單一，可能會(huì)導(dǎo)致植物中某些活性成分漏篩。為提高活性物質(zhì)產(chǎn)量和防止活性物質(zhì)漏篩，可進(jìn)一步選用不同極性的有機(jī)溶劑萃取活性物質(zhì)。本試驗(yàn)中胡椒科4種植物提取物對(duì)灰葡萄孢生長(zhǎng)發(fā)育各階段的抑制作用均小于化學(xué)藥劑嘧霉胺，這是因?yàn)楸驹囼?yàn)中的植物提取物為粗提物，其中殺菌活性成分含量較低，而這些有效成分具有強(qiáng)烈的抗菌活性。分離這些活性物質(zhì)并鑒定其分子結(jié)構(gòu)，有可能發(fā)現(xiàn)具有新型殺菌活性、新型作用機(jī)制的先導(dǎo)化合物，為胡椒科植物源農(nóng)藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。