邢冉冉，吳亞君，陳 穎

（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

近年來，國內(nèi)外食品摻假造假事件時(shí)有曝光，由此產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)影響引起世界各國的廣泛關(guān)注。隨著現(xiàn)代工業(yè)科技的迅速發(fā)展，摻假的手段和花樣也在不斷地翻新，從早期的缺斤短兩、勾兌稀釋等簡單形式發(fā)展到利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段進(jìn)行的“棄真存?zhèn)巍?。同時(shí)，隨著食品供應(yīng)鏈觸及的范圍更寬泛，涉及到的因素更為復(fù)雜，食品的產(chǎn)地溯源也變得更加困難。食品生產(chǎn)中摻假造假的鑒定和食品標(biāo)簽制度的有效實(shí)施都必須有完善的食品物種鑒定和產(chǎn)地溯源方法作為檢測的基礎(chǔ)。因此，對(duì)食品中的物種來源進(jìn)行有效鑒定是識(shí)別食品摻假造假問題的一項(xiàng)重要措施。

在過去的20 年中，大量基于DNA的分子檢測方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、基因芯片技術(shù)和分子指紋圖譜技術(shù)等得到迅速發(fā)展并在食品物種鑒定領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[1]。但是隨著檢測需求的日益變化，現(xiàn)有方法在一定程度上存在如程序復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、鑒定結(jié)果精確性低等不足。2003年加拿大動(dòng)物學(xué)家Paul Hebert教授首次提出了DNA條形碼的概念，一經(jīng)提出便迅速成為分子分類學(xué)以及分子鑒別技術(shù)的核心方法，在生物物種鑒定方面發(fā)揮了重要作用[2]。然而，無論是常規(guī)的基因檢測技術(shù)，還是DNA條形碼技術(shù)，通常一次只能檢測出一種或者少數(shù)幾種物種，而不能快速分析出數(shù)百萬的基因序列。而多數(shù)情況下，待測樣品通常是多種不同物種的混合物，且有些物種的含量占樣品總量的比例極低（低于1%）[3]。特別是隨著食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，食品的品種越來越多，加工越來越精細(xì)，成分越來越復(fù)雜，物種的原始特征已經(jīng)消失，因此同時(shí)對(duì)多物種進(jìn)行定性定量檢測的需求越來越大?；诟咄繙y序技術(shù)的宏條形碼技術(shù)在該方面具有良好的應(yīng)用前景。

本文對(duì)宏條形碼技術(shù)進(jìn)行了介紹，并對(duì)其在食品物種鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用、面臨的挑戰(zhàn)及發(fā)展前景進(jìn)行了探討。

1 宏條形碼技術(shù)概述

1.1 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼技術(shù)是利用基因組中一段標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA片段作為物種標(biāo)記，通過進(jìn)化樹分析來描述物種間的親緣關(guān)系，進(jìn)而對(duì)物種進(jìn)行鑒定的一項(xiàng)技術(shù)[4]。在過去的十幾年間，大量的科學(xué)研究機(jī)構(gòu)和組織已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)具有物種學(xué)信息的基因片段。其中，線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I（cytochrome oxidase subunit I，COI）的一個(gè)特定片段DNA序列作為分辨動(dòng)物界中近緣物種的標(biāo)準(zhǔn)片段[5]；葉綠體核糖激酶1,5-二磷酸羧化酶基因（ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase，rbcL）和蛋白成熟酶K基因（maturase K，matK）以及核基因片段（internal transcribed spacer，ITS）被用作植物DNA條形碼[6]；核糖體DNA則常被用作鑒定真菌和細(xì)菌等微生物的DNA條形碼[7]。

隨著生命條形碼聯(lián)盟（Consortium for the Barcode of Life，CBOL）的建立，DNA條形碼技術(shù)被迅速用于生物多樣性分析及保護(hù)、物種鑒定、生物的遺傳進(jìn)化、檢驗(yàn)檢疫、法醫(yī)學(xué)、生物安全與公共健康、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、道地藥材產(chǎn)地溯源、食品真?zhèn)舞b別和產(chǎn)地溯源等多個(gè)方面[8-11]。與傳統(tǒng)的分類手段相比，DNA條形碼技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）不受個(gè)體發(fā)育階段和基因片段的限制，甚至對(duì)已降解的樣品也可以進(jìn)行分析；2）加快了對(duì)已知物種的識(shí)別速度，同時(shí)便于發(fā)現(xiàn)新物種；3）加速了便攜式手持設(shè)備的研發(fā)，可以盡快實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場完成樣品的處理、擴(kuò)增、測序和鑒定；4）為生物的分類提供了條件[12-16]。然而，在顯現(xiàn)優(yōu)勢的同時(shí)，基于Sanger測序法的DNA條形碼技術(shù)的局限性也非常明顯，其中一點(diǎn)就是無法同時(shí)完成對(duì)多個(gè)體多物種混合樣品的高效快速分類及評(píng)估[17]。

1.2 基于高通量測序的宏條形碼技術(shù)

隨著對(duì)生命科學(xué)的深入研究與生物技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，人們對(duì)DNA測序技術(shù)的要求不斷提高，傳統(tǒng)的Sanger測序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)徹底改變了DNA分析的方式。以Illumina測序平臺(tái)為例，其主要技術(shù)特點(diǎn)就是可以邊合成邊測序，DNA片段加上接頭之后，可以隨機(jī)附著于玻璃表面，通過橋式PCR擴(kuò)增形成具有DNA分子克隆片段的DNA分子簇；基于可逆終止化學(xué)反應(yīng)的原理，對(duì)數(shù)百萬個(gè)片段同時(shí)進(jìn)行大規(guī)模平行測序；測序反應(yīng)結(jié)束后，成像系統(tǒng)能夠捕捉熒光標(biāo)記的核苷酸，其中一個(gè)簇的圖像數(shù)據(jù)就是一個(gè)DNA序列；隨后將圖像數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為堿基序列信息，完成測序。與傳統(tǒng)的Sanger測序技術(shù)只能對(duì)單一的DNA分子進(jìn)行測序不同，高通量測序技術(shù)可以獲得樣本中每個(gè)DNA分子的序列，具有測序通量高、速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)。近年來，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展成熟、測序成本的不斷降低和生物信息學(xué)分析軟件的進(jìn)一步完善，高通量測序技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)從最初的基因組科學(xué)研究逐漸延伸到生物技術(shù)、食品安全和醫(yī)藥衛(wèi)生等各個(gè)領(lǐng)域。

宏條形碼技術(shù)就是近年來隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展而出現(xiàn)的一種新型物種鑒定技術(shù)。這種技術(shù)結(jié)合了DNA條形碼技術(shù)和高通量測序技術(shù)的共同優(yōu)點(diǎn)，可以獲得來自于混合樣本中所有目標(biāo)DNA片段的序列，然后將這些序列與合適的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)即可確定其代表的物種，從而可以分析混合樣本中的物種組成[18]。2012年，Taberlet等[18]將宏條形碼技術(shù)定義為“利用從環(huán)境樣本中（例如土壤、水、糞便等）提取的總DNA和降解DNA來進(jìn)行高通量多物種鑒定的技術(shù)”。需要指出的是，宏條形碼與宏基因組是完全不同的兩個(gè)術(shù)語，前者不涉及到基因組水平上的任何功能分析。

宏條形碼技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)就是可以更加快速、準(zhǔn)確地對(duì)混合樣本或環(huán)境樣本中所包含的生物體進(jìn)行鑒定，能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)檢測復(fù)雜樣品中多個(gè)物種的目的。其優(yōu)點(diǎn)主要包括：1）測序?qū)ο鬄槎痰腜CR擴(kuò)增子，有利于對(duì)降解和低分子質(zhì)量的DNA樣品進(jìn)行分析；2）采用通用的PCR引物，因此可以對(duì)未知物種進(jìn)行分析；3）經(jīng)濟(jì)，同時(shí)對(duì)大量樣本分析降低了每個(gè)樣本的成本；4）深度測序，增加了檢出微量DNA的可能性[3]。這些優(yōu)點(diǎn)對(duì)于食品類型鑒定，特別是對(duì)于未知食品、復(fù)雜食品或者深加工食品來說有著非常重要的作用，為分析食品中的物種成分提供了一個(gè)新的研究手段。

在對(duì)食品中的物種成分進(jìn)行分析時(shí)，宏條形碼技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程基本包括6 個(gè)步驟[19]，具體見圖1。宏條形碼技術(shù)與DNA條形碼技術(shù)在實(shí)驗(yàn)流程上大致相同，但是在具體操作中，兩者又有很大不同，例如分子標(biāo)記的選擇、涉及到的測序技術(shù)和數(shù)據(jù)處理過程等。宏條形碼技術(shù)所涉及到的這些步驟看似簡單，但在實(shí)際操作過程中，遇到的問題及解決方案因研究目的而異，因此目前并沒有統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn)的詳細(xì)操作流程，各個(gè)步驟的具體操作還需要參考相關(guān)領(lǐng)域己有的研究來確定[20]。

圖1 宏條形碼鑒定食品物種成分的流程Fig. 1 Major steps of metabarcoding for food species identification

2 宏條形碼技術(shù)在食品物種鑒定中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的食品物種來源主要依靠生物的表型及解剖特征等進(jìn)行感官鑒定。但是對(duì)于加工處理后的食品，感官檢驗(yàn)的難度及準(zhǔn)確性將大大降低且感官檢驗(yàn)對(duì)檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高。在分子生物學(xué)技術(shù)得到成熟應(yīng)用之前，理化分析方法在食品種類和真?zhèn)舞b別中應(yīng)用最廣。隨著科學(xué)的發(fā)展，基于核酸的分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展很快，與理化方法不同，分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)物種的判別基礎(chǔ)是遺傳物質(zhì)，通過遺傳物質(zhì)從而保證檢測結(jié)果的確定性和重現(xiàn)性。如DNA芯片技術(shù)、指紋圖譜技術(shù)、DNA條碼技術(shù)等。但當(dāng)檢測對(duì)象是復(fù)雜食品、未知食品或者數(shù)量特別龐大的樣品時(shí)，這些傳統(tǒng)的分子檢測方法和DNA條形碼技術(shù)都開始顯現(xiàn)出不足之處。宏條形碼技術(shù)的出現(xiàn)為這一問題的解決提供了一種更加便捷經(jīng)濟(jì)的方案。

宏條形碼技術(shù)在物種鑒定方面的應(yīng)用早期主要集中在微生物群落多樣性的研究[21-22]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在真菌[23]、無脊椎動(dòng)物[24]、植物[25]的物種鑒定，食草和食肉動(dòng)物的飲食成分分析[26-27]以及環(huán)境樣品的生物多樣性[18,28-29]等研究中。宏條形碼技術(shù)已在食品物種鑒定方面有初步的研究，目前已經(jīng)逐漸應(yīng)用于動(dòng)物源性食品、植物源性食品、復(fù)雜食品和深加工食品的物種鑒定等方面。

2.1 動(dòng)物源性食品

不同肉類、禽類品種之間的價(jià)格差異很大，因此肉類產(chǎn)品的摻假主要是品種摻假。針對(duì)動(dòng)物源性食品摻假現(xiàn)象，宏條形碼技術(shù)的主要應(yīng)用對(duì)象是混合肉制品，這也體現(xiàn)了宏條形碼技術(shù)在混合樣品物種鑒定方面的優(yōu)勢。在一項(xiàng)針對(duì)動(dòng)物源食品DNA混合物物種成分鑒定的研究中，研究人員首先將豬、馬、牛、羊、兔、雞、火雞、山雞、鴨、鵝、鴿子、人類、老鼠共13 種生物的DNA按照不同比例進(jìn)行混合，然后以12S_KH（215～222 bp）、16S_KH（112～121 bp）和16S_Ki（243～249 bp）作為分子標(biāo)記，設(shè)計(jì)通用引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到目的基因片段[30]。隨后，在該實(shí)驗(yàn)中研究人員構(gòu)建測序文庫，并利用Ion Torrent（Life Technologies）測序平臺(tái)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，最后利用不同的比對(duì)算法對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。研究結(jié)果顯示，以利用Sanger測序法獲得的測序結(jié)果作為參照，利用此高通量測序方法測得的不同物種的序列錯(cuò)誤率在0.000 3～0.020 0之間，并能很好地將樣品中的不同物種成分進(jìn)行鑒別。與此研究類似，Tillmar等[3]利用初級(jí)版的高通量測序儀GS Junior對(duì)包含大量哺乳動(dòng)物物種的混合樣品物種成分進(jìn)行了準(zhǔn)確的鑒定，并檢測出了含量比例低至1%的物種成分。此項(xiàng)研究中所選用的分子標(biāo)記是一段長度約為100 bp的線粒體16S rRNA基因片段，這類序列長度相對(duì)較短的條形碼稱為DNA微型條形碼，主要應(yīng)用于DNA發(fā)生降解的一些樣品的鑒定。微型條形碼的出現(xiàn)不僅在一定程度上彌補(bǔ)了高通量測序技術(shù)測序長度有限的缺陷，還能夠有效地對(duì)DNA已大量降解的加工食品進(jìn)行鑒定。基于微型條形碼的這些特點(diǎn)，Galan等[31]以片段長度為136 bp的細(xì)胞色素b作為分子標(biāo)記片段，設(shè)計(jì)出嚙齒類動(dòng)物的通用引物，然后利用高通量測序儀454 GS-FLX較為高效地鑒定出了混合樣品中所包含的未知物種；此項(xiàng)研究的對(duì)象雖然是嚙齒動(dòng)物，但是對(duì)非嚙齒類動(dòng)物同樣有效，也可應(yīng)用于其他物種的鑒定，為宏條形碼技術(shù)在加工食品鑒定中的廣泛應(yīng)用奠定了理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于魚類產(chǎn)品的分類和鑒定，絕大多數(shù)常見的魚類都可以用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行鑒定[32]。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)則進(jìn)一步推動(dòng)了DNA條形碼技術(shù)在水產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。最近，Galal-Khallaf等[33]利用基于454測序平臺(tái)的宏條形碼技術(shù)對(duì)埃及水產(chǎn)飼料樣品中使用的魚類是否屬于瀕危物種進(jìn)行了研究；結(jié)果顯示，草食性魚和雜食性魚的飼料組成存在著細(xì)微差異；此研究還發(fā)現(xiàn)，在所檢測到的所有魚類中有大約46%的魚類存在被過度開發(fā)或者數(shù)量正在急劇減少的現(xiàn)象；在此項(xiàng)研究中，高通量測序技術(shù)為水產(chǎn)業(yè)中可追溯性系統(tǒng)的有效實(shí)施提供了工具。

2.2 植物源性食品

隨著國際貿(mào)易的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)的全球化，市場上的農(nóng)產(chǎn)品和植物源性食品來源越來越廣泛，種類也越來越多，對(duì)這類食品進(jìn)行真?zhèn)舞b別和產(chǎn)地溯源就變得愈加困難。在歐盟，針對(duì)相關(guān)問題，已有相應(yīng)的規(guī)定開始頒布并實(shí)施，例如食品中所含物種成分（包括過敏原）的正確標(biāo)識(shí)，橄欖油、葡萄酒和面食的摻假鑒定以及可可和咖啡的合法貿(mào)易界定等[34]。相比傳統(tǒng)的食品真?zhèn)舞b別方法，宏條形碼技術(shù)作為一種基于高通量測序技術(shù)而發(fā)展起來的新的物種鑒定技術(shù)，在目前植物源性食品的鑒定工作中應(yīng)用并不廣泛，但是已經(jīng)顯現(xiàn)出很大的優(yōu)勢，例如在混合植物源食品、加工食品的物種鑒定方面都將具有更大的應(yīng)用空間。

最近，Coutimho Moraes等[35]在基于DNA的植物和植源性膳食補(bǔ)充劑鑒別技術(shù)的綜述中就強(qiáng)調(diào)了利用高通量測序技術(shù)對(duì)植源性膳食補(bǔ)充劑和中草藥成分進(jìn)行檢測以及真?zhèn)舞b別的前沿性。綜述指出，除宏條形碼技術(shù)之外，基于高通量測序技術(shù)的靶向富集和葉綠體基因組測序同樣具有鑒別植物物種的巨大潛力；但是，其中涉及到的復(fù)雜生物信息學(xué)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)流程可能會(huì)限制此類技術(shù)的普遍使用。此外，對(duì)于食品的物種鑒定來說，對(duì)整個(gè)質(zhì)體進(jìn)行基因組測序還可能會(huì)存在一些其他問題，例如較難獲得質(zhì)體完整基因組或質(zhì)體基因組出現(xiàn)斷裂和降解等。因此，相比于其他基于高通量測序的食品物種鑒定技術(shù)，宏條形碼技術(shù)更有可能成為一種可以得到廣泛應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)化工具。

我國中醫(yī)藥理論有藥食同源的觀點(diǎn)。在中藥分析領(lǐng)域，高通量測序技術(shù)已經(jīng)開始得到應(yīng)用。例如，Coghlan等[36]利用羅氏GS Junior測序平臺(tái)對(duì)混合中藥樣品進(jìn)行了分析，以trnL和16S rRNA作為分子標(biāo)記，并利用宏條形碼技術(shù)在一些中藥中鑒定出了瀕危物種和一些可能有毒或致過敏的成分。在另外的一項(xiàng)針對(duì)六味地黃丸物種成分鑒定的研究中，Cheng Xinwei等[37]利用了NCBI等數(shù)據(jù)庫中所有已知的ITS2和trnL序列建立了小型數(shù)據(jù)庫，并基于此數(shù)據(jù)庫利用Parallel-Meta等方法搜索和鑒定六味地黃丸中的物種成分，利用Meta-Storms等方法對(duì)不同樣本的物種來源進(jìn)行比較，最后成功地對(duì)處方物種和非處方物種進(jìn)行了鑒定，有效地鑒定出了中藥的種類和產(chǎn)地。為了研究高通量測序技術(shù)在中藥鑒定中的分析效果，Ivanova等[38]分別利用Sanger測序和高通量測序技術(shù)對(duì)來自不同藥用植物以及不同生產(chǎn)商的共15 種中草藥添加物進(jìn)行了分類鑒定，研究結(jié)果顯示，相比于Sanger測序，高通量測序技術(shù)對(duì)低含量物種的檢出率更高。研究指出，宏條形碼的方法可以為植物和真菌的DNA檢測提供可靠的指導(dǎo)，并可用于原材料來源真實(shí)性保障以及生產(chǎn)過程和最終產(chǎn)品的污染控制。

2.3 復(fù)雜食品和深加工食品

對(duì)于復(fù)雜食品的真?zhèn)舞b別，從本質(zhì)上可以追溯為鑒定其生物成分。當(dāng)食品是多品種混合物時(shí)，其成分復(fù)雜且含量不一致。利用宏條形碼技術(shù)對(duì)復(fù)雜食品的成分進(jìn)行鑒定時(shí)，可以非特異性地將所有主要物種及雜質(zhì)物種都檢測出來，在生物混合體系研究方面具有更大的優(yōu)勢。

近年來消費(fèi)者對(duì)蜂蜜的需求量逐年增加，然而由于利益驅(qū)動(dòng)，蜂蜜摻雜使假的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，已成為目前蜂產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)中不容忽視的問題。蜂蜜中既包含植物源信息（蜜源植物），又包含動(dòng)物源信息（蜂源），鑒于蜂蜜的多物種來源特點(diǎn)，Prosser等[39]基于Ion Torrent PGM（Life Technologies）測序平臺(tái)，以ITS2、rbcLa和COI 3 個(gè)基因片段作為分子標(biāo)記，利用宏條形碼技術(shù)對(duì)7 種不同產(chǎn)地和加工方式的蜂蜜進(jìn)行了真?zhèn)舞b別。其中，核基因ITS2（約350 bp）用以鑒定蜂蜜中的花粉來源；葉綠體基因片段rbcLa（162 bp）用以鑒定蜂蜜中痕量或者降解的植物DNA；COI（120 bp）用以鑒定其蜜蜂來源。此研究利用宏條形碼技術(shù)對(duì)蜂蜜的植物來源和昆蟲來源進(jìn)行了較為準(zhǔn)確地鑒定，為蜂蜜的真?zhèn)舞b別和產(chǎn)地溯源提供了一個(gè)新的解決方案。與此類似，還有研究利用宏條形碼技術(shù)探尋動(dòng)植物之間的聯(lián)系，例如，Pornon等[40]利用宏條形碼技術(shù)對(duì)植物-昆蟲之間的聯(lián)系進(jìn)行了研究，通過將實(shí)驗(yàn)室檢測和現(xiàn)場檢測相結(jié)合，成功地對(duì)花粉混合物和昆蟲攜帶的花粉中的物種來源進(jìn)行了鑒別；此外，此項(xiàng)研究還顯示出宏條形碼技術(shù)在直接定量（以擴(kuò)增序列數(shù)目代表數(shù)量）和半定量（相對(duì)定量）方面的潛力。在蜂蜜的鑒別方面，還有一些研究將宏條形碼技術(shù)與其他檢測技術(shù)進(jìn)行了結(jié)合，例如Richardson等[41]利用Illumina MiSeq測序平臺(tái)，以ITS2（461～469 bp）作為分子標(biāo)記，利用宏條形碼技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)的顯微鏡觀察的方法對(duì)蜂蜜中花粉的來源進(jìn)行了分析。該研究結(jié)果表明：如果研究目標(biāo)是對(duì)花粉進(jìn)行定性分析，宏條形碼技術(shù)無論在靈敏度還是準(zhǔn)確率上都更有優(yōu)勢；如果研究目標(biāo)是對(duì)花粉進(jìn)行定量分析，聯(lián)合使用宏條形碼技術(shù)和顯微鏡觀察技術(shù)比單獨(dú)采用其中任何一種技術(shù)的效果更好。這一研究也提示我們，在食品物種鑒定的研究過程中，任何一種研究方法都有一定的局限性，而多種檢測方法聯(lián)合使用，具有單種方式不可比擬的優(yōu)勢。

在深加工食品的鑒定中，宏條形碼技術(shù)也已得到初步應(yīng)用。Mu?oz-Colmenero等[42]利用PGM測序平臺(tái)對(duì)不同類型糖果中所包含的動(dòng)物物種成分進(jìn)行了分析，以16S核糖體基因作為分子標(biāo)記，并將分析結(jié)果與常規(guī)的DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行比較；研究結(jié)果顯示：絕大多數(shù)利用PGM測序平臺(tái)進(jìn)行測序分析的結(jié)果與利用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行物種檢測的結(jié)果一致；而基于PGM測序平臺(tái)的高通量測序技術(shù)能夠從糖果樣品中檢測到更多的動(dòng)物物種，并且檢測的靈敏度更高；但是，利用PGM測序平臺(tái)獲得的物種序列中含有更高的堿基對(duì)AT含量。除此之外，該研究還指出利用高通量測序技術(shù)在分析復(fù)雜度相對(duì)較低的食品方面具有更大的優(yōu)勢，但在對(duì)高度加工的食品進(jìn)行物種鑒別和追溯的應(yīng)用方面尚不成熟。

3 宏條形碼技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)

雖然基于高通量測序的宏條形碼技術(shù)可以為生物學(xué)研究提供快速、簡便與經(jīng)濟(jì)的物種鑒定方法，在操作層面的難度也并不大，但是這一技術(shù)卻并非完美，仍有一些問題需要解決。首先，高通量測序技術(shù)雖然可以提供海量的數(shù)據(jù)，但卻存在一定的錯(cuò)誤率，測序質(zhì)量有待提高。尤其對(duì)于宏條形碼技術(shù)來說，因其是利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行文庫構(gòu)建后對(duì)該文庫進(jìn)行測序，因此容易產(chǎn)生文庫中堿基不平衡的現(xiàn)象（A、C、T、G 4 個(gè)堿基分布不均勻），導(dǎo)致測序儀在數(shù)據(jù)讀取時(shí)會(huì)產(chǎn)生誤差，使得測序數(shù)據(jù)質(zhì)量降低、有效數(shù)據(jù)量減少。其次，不同的樣品前處理?xiàng)l件和實(shí)驗(yàn)過程可能導(dǎo)致DNA的質(zhì)量和濃度出現(xiàn)較大的差別[43]，而DNA的完整性對(duì)宏條形碼技術(shù)和其他用于物種鑒定的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)效果都有較大的影響[37,44-45]。再次，雖然目前已有許多可用于宏條形碼數(shù)據(jù)分析的生物信息學(xué)方法，但是這些方法的識(shí)別率很大程度上與條形碼的選擇以及參考數(shù)據(jù)庫的組成直接相關(guān)[46-47]。此外，由物種間的可變引物-模板錯(cuò)配造成的PCR偏差可能會(huì)影響宏條形碼技術(shù)在定量方面的應(yīng)用，并且有可能導(dǎo)致某些物種無法檢測[48-49]。最后，宏條形碼技術(shù)的有效應(yīng)用需要有較好分類和較高條形碼覆蓋率的條形碼序列參考數(shù)據(jù)庫做后盾。

3.1 條形碼選擇的局限性

高通量測序技術(shù)的測序讀長普遍較短（長度為35～700 bp），而這可能是此技術(shù)在物種鑒定的應(yīng)用方面存在的一個(gè)比較大的限制因素。雖然一些長度為200～300 bp的微條形碼也可以用于物種鑒定，但是目前較常用的植物條形碼（rbcL和matK）長度大概都在500～600 bp之間。羅氏454焦磷酸測序平臺(tái)可以提供此長度范圍的讀長，這一平臺(tái)也已經(jīng)成功用于植物的宏條形碼測定[50-51]；但是，由于成本與應(yīng)用范圍過于狹小，454測序平臺(tái)已停產(chǎn)。目前，各方面發(fā)展較好的是Illumina公司的MiSeq測序平臺(tái)，其測序讀長可以達(dá)到雙側(cè)長度2×300 bp，且其測序準(zhǔn)確性相對(duì)較高（錯(cuò)誤率0.003～0.004）[6,52]；當(dāng)然，還有其他一些長讀長的測序平臺(tái)，例如Pacific Biosciences和Oxford Nanopore Technologies。每個(gè)測序平臺(tái)都有其優(yōu)劣，因此，在應(yīng)用宏條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒定時(shí)，除了要考慮條形碼的分辨率和引物的通用性等問題，還需要根據(jù)測序儀的測序長度來選擇合適的條形碼長度[53]。

對(duì)于DNA保存較為完整的樣品，其DNA提取較為容易，能夠擴(kuò)增出較長的目的片段，因此可以采用較長的條形碼，如長度為658 bp的COI基因片段[54]；對(duì)于DNA高度降解的樣品，其DNA提取較為困難，難以擴(kuò)增出較長的基因片段，因此只能選擇較短的條形碼，如長度約為130 bp的COI基因片段[55]。在條形碼的選擇方面，宏條形碼技術(shù)與傳統(tǒng)的DNA條形碼技術(shù)并不完全相同[18]。例如，在利用宏條形碼和傳統(tǒng)的DNA條形碼技術(shù)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行物種鑒定時(shí)，因?yàn)镃OI基因的高辨別度，所以通常都是選擇COI基因片段作為條形碼，但此基因的引物結(jié)合區(qū)域保守度并不高[56]。經(jīng)驗(yàn)表明，當(dāng)樣品中所包含的物種覆蓋分類范圍特別廣時(shí)，引物的變異性就會(huì)使得擴(kuò)增結(jié)果變得不可靠[57]。在使用傳統(tǒng)的DNA條形碼技術(shù)時(shí)，可以通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案從最初擴(kuò)增失敗的物種中獲取數(shù)據(jù)；而當(dāng)使用宏條形碼技術(shù)對(duì)混合樣品進(jìn)行鑒定時(shí)，可能由于樣品中其他類群的擴(kuò)增子掩蓋了某些未能擴(kuò)增的特定類群，使得實(shí)驗(yàn)方案的優(yōu)化較為困難。

在物種信息的確定方面，宏條形碼技術(shù)與傳統(tǒng)的DNA條形碼技術(shù)相同，得到的未知靶標(biāo)都必須要與參考數(shù)據(jù)庫中已被鑒定的靶標(biāo)進(jìn)行比對(duì)才能獲知物種信息；因此在利用宏條形碼技術(shù)時(shí)，參考數(shù)據(jù)庫的不完善成了一個(gè)很大的受限因素[58]。具體到宏條形碼技術(shù)在食品中的應(yīng)用，其局限性還包括：1）加工食品中的DNA通常是高度降解的，一些較長的基因長片段可能并不能完全準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出來；2）在一些復(fù)雜食品中，由于多個(gè)物種需要在同一個(gè)PCR管中擴(kuò)增目的條帶，這就要求所用的引物必須具有高度通用性，也就是說在各物種間擴(kuò)增效率要一致。

簡言之，在利用宏條形碼技術(shù)對(duì)食品中的物種成分進(jìn)行鑒定時(shí)，對(duì)于條形碼的選擇有一定的局限性，也因此變得非常關(guān)鍵。在實(shí)際的研究工作中，應(yīng)該尋找通用性和特異性較強(qiáng)的基因片段作為標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼。同時(shí)，為了減少由于條形碼選擇不當(dāng)而帶來的誤差，多個(gè)條形碼的聯(lián)合使用有時(shí)非常有必要。大量的研究結(jié)果表明，使用多個(gè)條形碼可以更全面地鑒定到樣本中所包含的物種，更準(zhǔn)確地區(qū)分不同物種[30,53,59]；尤其當(dāng)樣本中包含的物種類型十分廣泛時(shí)，由于每個(gè)條形碼能夠鑒定到的物種類群不同，聯(lián)合使用多個(gè)條形碼有助于更好地達(dá)到研究目的。此外，急需構(gòu)建包含多種食品物種的條形碼參考數(shù)據(jù)庫，可為宏條形碼技術(shù)的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

3.2 定量的局限性

定量問題是目前在應(yīng)用宏條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒定時(shí)存在的一個(gè)相對(duì)難以解決的問題，這是由于在此技術(shù)的應(yīng)用過程中，存在PCR偏差、基因的多拷貝性以及實(shí)驗(yàn)流程的不同等問題，這會(huì)導(dǎo)致測得序列的數(shù)量與實(shí)際樣品中的物種數(shù)量并沒有很強(qiáng)的相關(guān)性；因此難以利用該技術(shù)對(duì)樣品中的物種成分進(jìn)行定量分析。目前普遍認(rèn)為定量困難主要是由PCR過程中引物和模板錯(cuò)配以及純粹的隨機(jī)效應(yīng)而造成的[20,60]。在利用宏條形碼技術(shù)時(shí)，需要設(shè)計(jì)特異性探針，然后與基因組DNA進(jìn)行雜交，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后得到基因組目標(biāo)區(qū)域的DNA片段；這個(gè)過程造成了該方法存在一個(gè)較大的缺陷，即PCR過程會(huì)產(chǎn)生偏差[20,60]。PCR偏差與引物-模板錯(cuò)配、寡聚核苷酸的濃度、退火溫度和PCR循環(huán)數(shù)等因素有關(guān)[48]；其中，引物-模板錯(cuò)配起最主要的作用[48]，這與通用引物的選擇有一定的關(guān)系；但是不管選擇何種通用引物，都不能避免引物與模板的錯(cuò)配發(fā)生[61-62]，最終都會(huì)導(dǎo)致一些物種的相對(duì)豐度增加，另外一些物種的相對(duì)豐度降低，甚至還會(huì)出現(xiàn)目標(biāo)片段無法得到擴(kuò)增的現(xiàn)象[48]。即使某種通用引物能夠?qū)⑺械奈锓N都擴(kuò)增出來，但是由于不同物種間出現(xiàn)錯(cuò)配的情況不可能完全相同，也不能解決擴(kuò)增效率不一致的問題。

事實(shí)上，關(guān)于利用高通量測序技術(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序的情況，很少有研究指出能夠利用此技術(shù)對(duì)樣品中的物種成分進(jìn)行定量分析。雖然有報(bào)道提到測序的相對(duì)豐度與樣品中的物種含量存在一定的相關(guān)性[63]，但也僅是變化趨勢大致相同而已，并不完全相關(guān)，而且測定序列的相對(duì)豐度與樣品中的物種含量在一些細(xì)節(jié)上也有出入。在宏條形碼技術(shù)的應(yīng)用研究中，很多研究都會(huì)對(duì)定量問題進(jìn)行討論，但是至今還未得到一個(gè)完美的解決方案；大部分文獻(xiàn)都認(rèn)為利用宏條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒定時(shí)，序列的相對(duì)豐度與樣品中物種含量的相對(duì)豐度不存在相關(guān)性[39,48,64]。因此，目前看來，測定序列的相對(duì)豐度并不能作為對(duì)樣品中物種含量進(jìn)行定量分析的依據(jù)。

目前，針對(duì)宏條形碼技術(shù)實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的偏差因素進(jìn)行改善的措施主要集中在改變單個(gè)物種產(chǎn)生的偏差，或者是改善實(shí)驗(yàn)步驟方面[65-66]。最近也有一些研究針對(duì)偏差的修正問題進(jìn)行了探討，認(rèn)為不同物種間模板DNA的拷貝數(shù)或者DNA的濃度不同可能造成一些物種過量擴(kuò)增，而另外一些物種擴(kuò)增量較低的現(xiàn)象[67-68]。通過修正拷貝數(shù)和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法可以在一定程度上提高宏條形碼技術(shù)對(duì)于物種定量的能力；此外，還可以通過設(shè)置對(duì)照組來修正單個(gè)樣品在實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的偏差[69-70]。但是，除此之外還存在其他的技術(shù)因素阻礙了研究人員利用測定序列數(shù)的比例來判斷樣品中各物種的量或者比例。為了控制實(shí)驗(yàn)過程中由偏差帶來的影響，Thomas等[71]通過將目標(biāo)物種和對(duì)照物種按照50∶50的比例進(jìn)行混合，得到可以修正多種來源偏差的修正因子。這種通過計(jì)算修正因子來降低實(shí)驗(yàn)偏差影響的方法可以在一定程度上評(píng)估和修正宏條形碼研究中出現(xiàn)的偏差；但是，此方法僅適用于在目標(biāo)物種已知，且目標(biāo)物種種類有限的情況下對(duì)混合物中的物種成分進(jìn)行定量。

為了解決由于PCR擴(kuò)增過程中的偏差引起的定量困難問題，一些研究人員開始嘗試?yán)@過PCR步驟，直接對(duì)提取的DNA進(jìn)行測序分析。這種實(shí)驗(yàn)方法與目前的宏基因組測序方法類似[72-73]，但是其實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)并不是對(duì)全基因組進(jìn)行拼接或者尋找功能基因，而是通過具有代表性的DNA片段來進(jìn)行物種鑒定。具體做法是，對(duì)感興趣的基因組區(qū)域設(shè)計(jì)特異性探針，與基因組DNA進(jìn)行雜交，將目標(biāo)基因組區(qū)域的DNA片段進(jìn)行富集后，再利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序。這種測序方法稱為目標(biāo)捕獲測序，但是這種方法還是無法徹底解決定量的問題；因?yàn)槟壳吧袩o法確定此類實(shí)驗(yàn)中涉及到的包含物種信息的序列讀長，如線粒體、葉綠體和核糖體DNA的比例等信息[18]。例如，不同物種間核糖體的拷貝數(shù)各不相同[74]，即使是同一物種，不同組織部位不同細(xì)胞中的線粒體基因組的數(shù)量也有不同[75]，這些因素都會(huì)影響到定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

鑒于以上方法都無法完全解決利用高通量測序技術(shù)對(duì)食品中的物種成分進(jìn)行定量分析的問題，一些研究也在嘗試?yán)萌蚪M測序的方法來解決這一難題。2014年，Ripp等[76]利用Illumina公司的 HiSeq 2000測序平臺(tái)對(duì)包含哺乳動(dòng)物（豬、牛、馬、羊）和禽類（雞、火雞）在內(nèi)的肉制品的肉腸進(jìn)行了全基因組深度測序，隨后對(duì)測定的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；其所建立的方法一方面可以從復(fù)雜的物種中準(zhǔn)確地鑒別出特定物種，另一方面也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜食品中的主要成分和未知成分進(jìn)行定量分析。但是，這項(xiàng)研究僅僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)已知物種成分的定量分析，所建立的參考數(shù)據(jù)庫也僅僅包含少數(shù)幾種物種。而且到目前為止，全基因組測序的成本仍然很高，且參考基因組的數(shù)量有限。因此，對(duì)復(fù)雜食品中的所有未知物種成分進(jìn)行全基因組測序，不管是從成本還是數(shù)據(jù)分析方面來說，都有很大的挑戰(zhàn)。

4 結(jié) 語

目前，在食品物種鑒定方面，高通量測序技術(shù)雖然已經(jīng)得到了應(yīng)用，但在國內(nèi)外尚處于起步階段。與此形成鮮明對(duì)比的是該技術(shù)在人類疾病診斷和預(yù)防中的研究及應(yīng)用實(shí)例已經(jīng)不計(jì)其數(shù)，并且在國內(nèi)外均有經(jīng)審批上市的診斷產(chǎn)品用于無創(chuàng)產(chǎn)前、腫瘤分型、遺傳病篩查等方面的日常臨床實(shí)踐。一方面，由于高通量測序技術(shù)對(duì)于食品物種鑒定領(lǐng)域來說相對(duì)較新穎，且目前的測序成本相對(duì)來說較高，所以只有在基礎(chǔ)設(shè)施相當(dāng)完善的實(shí)驗(yàn)室才能應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)；另一方面，測序之前的準(zhǔn)備工作也缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，例如樣品處理、DNA提取等。最重要的一點(diǎn)，這一系列的生物信息學(xué)分析流程掌握起來相對(duì)困難，對(duì)測序結(jié)果的解讀也有一定的技術(shù)要求，尤其是當(dāng)檢測的基序比對(duì)不到具體物種時(shí)；例如，當(dāng)檢測的樣品為深度加工食品和復(fù)雜食品時(shí)，測序結(jié)果的完整解讀就存在很大的困難。在數(shù)據(jù)分析階段，雖然目前已有一些專門的軟件可以對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析，但是仍然需要更加準(zhǔn)確有效的分析手段；同時(shí)為了完成一系列的生物信息學(xué)分析流程，高技能的生物信息學(xué)專業(yè)人員也是必不可少的[77-78]。只有當(dāng)高通量測序技術(shù)達(dá)到操作自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化之后，這種方法才能真正廣泛地應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域的相關(guān)工作中。

雖然基于高通量測序的宏條形碼技術(shù)在食品物種鑒定的實(shí)際應(yīng)用中還需要不斷改進(jìn)，但其仍然具有快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。隨著測序讀長的增加、理論與技術(shù)的不斷完善，宏條形碼技術(shù)的應(yīng)用將使復(fù)雜食品的物種鑒定研究變得更加快速簡便。尤其是在過去的10 年中，技術(shù)的不斷發(fā)展已經(jīng)大大降低了測序的成本，并且顯著增加了測序的通量；全（半）自動(dòng)的生物信息學(xué)分析軟件也已開發(fā)出來；所有這些技術(shù)進(jìn)步都預(yù)示著高通量測序技術(shù)的成本在未來會(huì)不斷降低至可接受水平。

此外，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，單分子測序或第三代測序已經(jīng)開始興起并得到應(yīng)用。單分子測序技術(shù)的突出優(yōu)點(diǎn)為：1）無需PCR擴(kuò)增，直接對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行測序；2）具有更快的速度和更低的成本；3）測序讀長更長。這些特點(diǎn)對(duì)于宏條形碼技術(shù)的應(yīng)用將會(huì)起到推動(dòng)作用。相信在不久的將來，宏條形碼技術(shù)會(huì)更加簡單、便宜，并能得到更廣泛的應(yīng)用，這類檢測方法在食品安全領(lǐng)域也將占據(jù)更大的空間；在未來的食品安全監(jiān)管中，這一分析技術(shù)也將成為不可或缺的重要組成部分。