劉艷雙，侯 燾，郭丹郡，劉維維，石 文，何 慧,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

膠原肽（collagen peptides，CPs）是膠原蛋白或明膠經(jīng)酶解后的分子質(zhì)量幾百至幾千Da不等的產(chǎn)物，具有美容[1-2]、降血壓[3-5]、抗癌[5]、抗氧化[6-9]、促進(jìn)骨代謝[10-12]、傷口愈合[13]、抑菌[14]等多種生理功能。貢雯玉等[15]采用高效液相色譜法檢測(cè)鯽魚(yú)（Carassius auratus）不同組織中膠原蛋白含量，結(jié)果顯示魚(yú)皮、魚(yú)肉組織中膠原蛋白含量分別為106.62、24.75 mg/g，可見(jiàn)以鯽魚(yú)皮為原料提取膠原蛋白，制備生物活性膠原肽，既可以實(shí)現(xiàn)下腳料的再利用，又可以滿(mǎn)足人們對(duì)膠原蛋白安全性和產(chǎn)量的需求。

我國(guó)營(yíng)養(yǎng)調(diào)查結(jié)果表明，國(guó)民鈣攝入量普遍偏低，每天約為400～500 mg，僅達(dá)到推薦量的50%左右。僅僅通過(guò)提高飲食中鈣的絕對(duì)含量，仍不能有效改善缺鈣現(xiàn)象。在補(bǔ)鈣的同時(shí)增加飲食中促鈣吸收因子的攝入，提高機(jī)體對(duì)鈣的有效吸收，將是有效之策。VD[16]、酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）[17-18]、卵黃高磷蛋白肽（phosvitin peptides，PPPs）[19]、菊粉[20]等都是已知的具有良好促鈣吸收作用的生物活性物質(zhì)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究?jī)A向于從食品加工下腳料中提取蛋白用于生物活性肽的制備，如魚(yú)骨[21]和魚(yú)鱗[22]、咸鴨蛋清[23-24]等。成靜等[25]以膠原肽螯合鈣（200～400 Da小肽）為受試物，通過(guò)測(cè)定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中血清鈣、股骨鈣含量及股骨指數(shù)，評(píng)價(jià)膠原肽鈣螯合物對(duì)缺鈣模型小鼠具有補(bǔ)鈣功能。分子質(zhì)量在20 000 Da以下，特別是4 000～6 000 Da的水解明膠能有效改善和抑制骨強(qiáng)度的下降，維持骨的機(jī)能，預(yù)防骨折，是預(yù)防、治療骨質(zhì)疏松癥的有效成分[26]。鯽魚(yú)是我國(guó)國(guó)民消費(fèi)的大眾品種，在淡水魚(yú)中營(yíng)養(yǎng)最為豐富，本實(shí)驗(yàn)以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立低鈣膳食模型，通過(guò)考察血清、骨生物學(xué)及骨微觀結(jié)構(gòu)，對(duì)鯽魚(yú)皮膠原肽促進(jìn)鈣吸收及增加骨密度進(jìn)行研究，以期為鯽魚(yú)皮下腳料的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

昆明雄性小鼠，3～4 周齡，體質(zhì)量20～22 g，湖北省動(dòng)物研究中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK（鄂）：2015-0018。

CPPs（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%） 南京通升食品配料有限公司；血清鈣試劑盒、血清磷試劑盒、血清堿性磷酸酶試劑盒 南京建成生物生物有限公司；碳酸鈣（鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)36.8%）、鹽酸、硝酸、高氯酸（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型電子天平 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)德國(guó)賽多利斯股份公司；Laborota4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器德國(guó)Heidolph公司；板式膜（截留分子質(zhì)量小于5 kDa）美國(guó)Millipore公司；AA-6300C原子吸收分光光度儀日本島津公司；Exploit數(shù)顯游標(biāo)卡尺 開(kāi)拓工具有限公司；TA.XT.PLUS物性測(cè)試儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；XR-46雙能X射線(xiàn)骨密度儀 美國(guó)Norland公司；JEOL JSM-6390/LV掃描電子顯微鏡 日本NTC公司；Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司；DM3000熒光顯微鏡 徠卡儀器（德國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鯽魚(yú)皮CPs的制備

將膠原蛋白用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為3 g/100 mL的溶液，沸水浴中加熱，并攪拌20 min，冷卻后放入恒溫水浴攪拌器中，設(shè)置溫度為50 ℃，調(diào)至pH 7.0后，加入復(fù)合蛋白酶（加酶量3×103U/g），滴加1 mol/L NaOH溶液使酶解pH值維持在7.0左右，并記錄加堿量，酶解3 h后，沸水浴加熱10 min，使酶鈍化，冷卻至室溫后，4 000 r/min離心10 min，取上清液。將上述酶解液通過(guò)截留分子質(zhì)量小于5 kDa的超濾膜，將超濾膜透過(guò)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥，得到分子質(zhì)量小于5 kDa的膠原肽CPs（用凱氏定氮法測(cè)得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于90%）。

1.3.2 動(dòng)物低鈣飼料配方

參照美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)AIN-93嚙齒類(lèi)動(dòng)物純化飼料配方標(biāo)準(zhǔn)并略作修改，制作小鼠低鈣飼料。低鈣飼料由南通特洛菲飼料科技有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料高科技平臺(tái)）制作，配方為（以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)）：酪蛋白21.85%、玉米淀粉48.10%、蔗糖10.00%、玉米油5.00%、纖維素5.00%、半胱氨酸0.30%、氯化膽堿0.25%、礦物鹽混合物0.35%（含0.1%鈣）、維生素混合物1.00%。

1.3.3 動(dòng)物分組及給藥

4 周齡昆明雄性小鼠60 只，按體質(zhì)量隨機(jī)分成6 組，分別為正常組、低鈣模型組、碳酸鈣組、CPs低劑量組（CPs低＋CaCO3）、CPs高劑量組（CPs高＋CaCO3）、CPPs對(duì)照組（CPPs＋CaCO3），適應(yīng)喂養(yǎng)1 周后，期間自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)采取灌胃方式給予各組相應(yīng)藥品。正常組喂食正常飼料（鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%），其余各組喂食低鈣飼料（鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%），各組碳酸鈣劑量參照人體每日推薦攝入量800 mg/60 kg mb（13.33 mg/kg mb）的10 倍，設(shè)置為133.3 mg/kg mb，選擇CPPs、CPs低、高劑量分別為500、500、1 000 mg/kg mb。

1.3.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

實(shí)驗(yàn)期間，兩天記錄一次小鼠體質(zhì)量，6 周實(shí)驗(yàn)期滿(mǎn)后，禁食12 h，眼球取血，4 ℃條件下3 500 r/min離心分離血清，待測(cè)血清指標(biāo)，脫頸椎處死。實(shí)驗(yàn)至第5 周末，將小鼠移入代謝籠進(jìn)行鈣代謝實(shí)驗(yàn)。期間定時(shí)灌胃，準(zhǔn)確記錄飼料攝入量，收集糞便凍干稱(chēng)質(zhì)量。糞鈣量采用原子吸收分光光譜法測(cè)定。鈣的攝入量、表觀吸收率分別按照公式（1）、（2）計(jì)算。

血清生化指標(biāo)測(cè)定：血清鈣、血清磷和堿性磷酸酶含量均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求的條件和程序進(jìn)行測(cè)定。

股骨、脛骨指標(biāo)測(cè)定：取出兩側(cè)股骨、脛骨，去除肌肉及軟組織后，測(cè)量長(zhǎng)度及骨鈣含量，用浸泡過(guò)生理鹽水的紗布包裹骨頭，－20 ℃保存?zhèn)溆?。骨礦物密度（bone mineral density，BMD）及骨礦物含量（bone mineral content，BMC）采用XR46雙能X射線(xiàn)骨密度儀測(cè)定。

骨微觀結(jié)構(gòu)觀察：取各組小鼠處理后的脛骨烘干至恒質(zhì)量，掃描電子顯微鏡下觀察脛骨表面結(jié)構(gòu)。

骨小梁形態(tài)學(xué)觀察：剝離小鼠右側(cè)股骨，將附著的肌肉和筋膜剔除干凈，然后浸入4%的多聚甲醛中固定，固定后逐級(jí)脫水，硝酸法脫鈣，石蠟切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，100 倍光學(xué)顯微鏡觀察脛骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 CPs對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

表1 CPs對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響（n＝6）Table1 Effects of CPs on serum biochemical parameters of mice (n= 6)

由表1可知，與模型組相比，正常組、碳酸鈣組、CPs低劑量組、CPs高劑量組和CPPs對(duì)照組血清鈣、血清磷含量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；但CPs低劑量組、CPs高劑量組、CPPs組和碳酸鈣組血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力卻顯著降低（P＜0.05）；且CPs低劑量組血清ALP活力顯著低于碳酸鈣組（P＜0.05）。

2.2 CPs對(duì)小鼠鈣代謝的影響

圖1 各組小鼠鈣表觀吸收率Fig. 1 Apparent calcium absorption rate of mice

從圖1可知，由于低鈣模型組處于鈣缺乏狀態(tài)，其鈣表觀吸收率顯著高于正常組、碳酸鈣組、CPs低劑量組、CPs高劑量組、CPPs對(duì)照組（P＜0.05）；CPs低劑量組、CPs高劑量組、CPPs對(duì)照組的鈣表觀吸收率顯著高于正常組、碳酸鈣組（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，補(bǔ)充碳酸鈣、CPs、CPPs可增加鈣在小鼠體內(nèi)的表觀吸收率，補(bǔ)充CPs效果與公認(rèn)補(bǔ)鈣肽CPPs相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；CPs低劑量組、CPs高劑量組其鈣表觀吸收率顯著高于碳酸鈣組（P＜0.05）。

2.3 CPs對(duì)小鼠股骨、脛骨干質(zhì)量指數(shù)和長(zhǎng)度的影響

表2 CPs對(duì)小鼠股骨、脛骨干質(zhì)量指數(shù)和長(zhǎng)度的影響（n＝6）Table2 Effect of CPs on length and dry mass index of femurs and tibiae in mice (n= 6)

由表2可知，與正常組相比，模型組的股骨、脛骨長(zhǎng)度和干質(zhì)量指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；CPs低劑量組各指標(biāo)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。CPs低劑量組其脛骨干質(zhì)量指數(shù)顯著高于CPs高劑量組（P＜0.05）；其股骨、脛骨干質(zhì)量指數(shù)、脛骨長(zhǎng)度與CPPs對(duì)照組相比，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但股骨長(zhǎng)度卻顯著高于CPPs對(duì)照組（P＜0.05），提示低劑量CPs組比同劑量的CPPs補(bǔ)鈣效果略好。

2.4 CPs對(duì)小鼠股骨脛骨骨鈣含量、遠(yuǎn)心端BMD、BMC的影響

表 3 CPs對(duì)小鼠股骨、脛骨骨鈣含量、BMD、BMC的影響（n＝ 6）Table3 Effect of CPs on calcium content, BMD and BMC of femurs and tibiae in mice (n= 6)

由表3可知，與模型組相比，正常組、CPs低劑量組、CPPs對(duì)照組其股骨鈣含量、遠(yuǎn)心端BMD、BMC顯著提高（P＜0.05）；與碳酸鈣組相比，CPs低劑量組股骨骨鈣含量顯著提高（P＜0.05）。與模型組相比，正常組、CPs低劑量組、CPs高劑量組、CPPs對(duì)照組脛骨鈣含量、遠(yuǎn)心端BMD、BMC顯著提高（P＜0.05）。與CPs高劑量組相比，CPs低劑量組脛骨遠(yuǎn)心端BMD顯著增加（P＜0.05）；與CPPs對(duì)照組相比，CPs低、高劑量組遠(yuǎn)心端BMC無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.5 CPs對(duì)小鼠脛骨表面微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖2 各組小鼠脛骨掃描電子顯微鏡圖（×500）Fig. 2 Scanning electron microscope of tibiae in mice (× 500)

從圖2可以看出，正常組在電子顯微鏡下表面幾乎無(wú)明顯孔隙，呈較淺溝壑狀。與正常組相比，模型組骨骼表面疏松多孔、孔徑較大，碳酸鈣組、CPs低劑量組、CPs高劑量組、CPPs對(duì)照組疏松情況明顯改善，孔徑變小、排列緊密，其中CPs高劑量組表面平整，CPs低劑量組表面與正常組較為相似。

2.6 CPs對(duì)小鼠股骨骨小梁結(jié)構(gòu)的影響

圖3 各組小鼠股骨HE染色（×100）Fig. 3 Hematoxylin-eosin staining of femurs in mice (× 100)

從圖3可以看出，正常組單位面積骨小梁數(shù)目多且緊密排列，無(wú)明顯溶解斷裂現(xiàn)象；模型組單位面積骨小梁數(shù)目明顯減少，斷裂溶解嚴(yán)重；與模型組相比，碳酸鈣組、CPs低劑量組、CPs高劑量組、CPPs對(duì)照組骨小梁數(shù)目增加，有序緊密連接，無(wú)明顯斷裂現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，CPs可以增加骨小梁數(shù)目及強(qiáng)度，從而促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以昆明雄性小鼠為研究對(duì)象，在成功建立小鼠缺鈣模型的基礎(chǔ)上，研究CPs對(duì)小鼠鈣吸收的促進(jìn)作用。

喂食低鈣飼料小鼠的血清ALP活力、骨長(zhǎng)度、骨干質(zhì)量指數(shù)、骨鈣含量、遠(yuǎn)心端BMD、BMC含量均顯著低于正常組，表明小鼠缺鈣模型構(gòu)建成功。鈣的吸收主要發(fā)生在小腸，小腸吸收的鈣占鈣吸收總量的90%[27]，通過(guò)飲食攝取的鈣不同時(shí)，機(jī)體對(duì)鈣的吸收率也會(huì)不同；當(dāng)機(jī)體處于鈣缺乏狀態(tài)下，鈣的吸收率會(huì)顯著提高。本研究中小鼠鈣代謝實(shí)驗(yàn)表明，低鈣組小鼠處于嚴(yán)重鈣缺乏狀態(tài)，故其鈣吸收率顯著高于其他各組。CPs低、高劑量組鈣吸收率顯著高于正常組和碳酸鈣組，表明灌胃無(wú)機(jī)鈣與食物攝取鈣的鈣吸收效果相當(dāng)，而同時(shí)灌胃CPs時(shí)，其鈣吸收率顯著高于僅灌胃無(wú)機(jī)鈣的碳酸鈣組，表明CPs可以促進(jìn)鈣在腸道中的吸收，從而達(dá)到促鈣吸收的效果。股骨指數(shù)可以反映骨骼生長(zhǎng)。模型組小鼠處于鈣缺乏狀態(tài)，骨長(zhǎng)度、骨干質(zhì)量指數(shù)顯著低于正常組、碳酸鈣組、CPs低、高劑量組和CPPs組；血清鈣與骨鈣水平維持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)血鈣出現(xiàn)降低趨勢(shì)，甲狀旁腺激素會(huì)促進(jìn)骨鈣釋放入血，以維持血鈣穩(wěn)定，因此內(nèi)環(huán)境血鈣較為穩(wěn)定。血清磷參與內(nèi)環(huán)境的緩沖體系，故本實(shí)驗(yàn)中各組之間血清鈣、磷無(wú)顯著差異。與此同時(shí)骨中成骨細(xì)胞活躍，合成血清ALP，使之釋放進(jìn)入血液，此時(shí)會(huì)發(fā)生高骨轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，表現(xiàn)為血清ALP活力的升高、骨鈣、遠(yuǎn)心端BMD、BMC的降低。掃描電子顯微鏡、HE染色結(jié)果可以看出模型組小鼠骨表面疏松多孔，骨小梁變細(xì)且出現(xiàn)明顯斷裂現(xiàn)象，正常組與CPs組、CPPs組情況有明顯改善。從CPs低、高劑量組各指標(biāo)比較可以看出，低劑量組促鈣吸收效果優(yōu)于高劑量組，但組間無(wú)顯著性差異，這可能是由于CPs通過(guò)與鈣形成螯合物防止鈣在小腸中的沉積從而達(dá)到促鈣吸收效果，而當(dāng)CPs濃度過(guò)高時(shí)，由于鈣離子已全部參與反應(yīng)，肽的螯合率可能會(huì)有所下降所致。

由以上分析可得出如下結(jié)論：CPs通過(guò)提高鈣在小腸的吸收率，增加骨鈣含量、遠(yuǎn)心端BMD、BMC，從而達(dá)到促鈣吸收作用；同時(shí)增加骨小梁強(qiáng)度，促進(jìn)鈣在骨骼上的沉積，改善低鈣膳食引起的骨質(zhì)疏松。