石 浩，王仁才，吳小燕，劉 瓊

（湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta Sieb.et Zucc.）為獼猴桃科獼猴桃屬多年生落葉藤本植物，是9 種光果獼猴桃之一[1]。在我國主要分布于東北地區(qū)、華北地區(qū)、長江流域及山東省，在朝鮮、日本、俄羅斯亦有分布[2]。據(jù)相關(guān)研究報道，軟棗獼猴桃中含有大量的功效成分物質(zhì)，如黃酮類[3]、生物堿類[4]、多酚類、花色苷類[5]、多糖類[6]、萜類[7-8]、脂肪酸類[9]等。其中黃酮類物質(zhì)主要有檞皮素-3-O-蕓香糖苷、異檞皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、5,7,3’,4’-四羥基黃酮醇等[10]。黃酮類物質(zhì)是一種天然抗氧化劑，對自由基具有一定的清除作用，能起到抗氧化[11-12]、防止動脈粥樣硬化[13]、延緩衰老[14-15]等作用。自由基屬于體內(nèi)的一種高能分子，能夠破壞細胞膜，降低細胞活性，加速細胞內(nèi)沉積物的生成，引發(fā)各種并發(fā)癥[16-17]。同時，當前生態(tài)環(huán)境污染的日益嚴重以及精神、物質(zhì)生活壓力的增加直接或間接地導致了人體內(nèi)自由基含量的增加[18-19]；因此，對控制機體內(nèi)自由基數(shù)量的研究是非常必要的。人永生化表皮細胞（HaCaT細胞）保留了表皮全層的分化能力，與正常人角質(zhì)細胞非常接近，且其培養(yǎng)方法與原代細胞培養(yǎng)相比相對簡單，可以不限次數(shù)的傳代[20-21]，故選取HaCaT細胞建立過氧化氫（H2O2）氧化損傷模型，并用此模型進行抗氧化物質(zhì)的相關(guān)評價與研究。本研究以湖南省瀏陽市大圍山軟棗獼猴桃為原料，運用噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）法，以細胞內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平為評價指標，考察軟棗獼猴桃黃酮類物質(zhì)對HaCaT細胞的抗氧化作用，為軟棗獼猴桃天然抗氧化功能產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

軟棗獼猴桃為湖南瀏陽市大圍山野生嫁接馴化品種。

蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氯仿、正丁醇、VC國藥集團化學試劑有限公司；HaCaT細胞 長沙湘雅醫(yī)院；1640高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、Gibco胰酶消化液 美國Thermo Fisher Scientific公司；MTT 美國Sigma公司；二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒康為世紀生物科技有限公司；SOD檢測試劑盒 南京建成生物科技有限公司；ROS檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動酶標洗板機、多功能酶標分析儀 深圳市匯松科技發(fā)展有限公司；自動平衡離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱 上海三騰儀器有限公司；倒置生物顯微鏡 北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司；FACSCalibur流式細胞分析儀 美國BD公司；冷凍干燥儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；低速離心機、搖床、精密電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 供試樣的制備

軟棗獼猴桃果實干燥粉末經(jīng)體積分數(shù)70%的乙醇溶液超聲提取，提取液經(jīng)濃縮后加入1/3體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇＝4∶1，V∶V）混合振蕩20 min后靜置15 min，除去水層與溶劑交界處的變性蛋白質(zhì)；濾液經(jīng)X-5大孔吸附樹脂和聚酰胺層析柱相繼洗脫，得到初步純化的黃酮溶液，將其冷凍干燥成粉末，其純度為80.43%。

1.3.2 VC、黃酮質(zhì)量濃度的篩選

參考文獻[13,22]進行VC、黃酮質(zhì)量濃度的篩選。使用無菌的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解VC和黃酮粉末，室溫下避光存放24 h，混勻后使用0.22 μm針頭濾器過濾除菌，貯存于4 ℃待用。有效期4 周。其中黃酮設(shè)0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 7 個質(zhì)量濃度組，VC設(shè)0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg/mL 8 個質(zhì)量濃度組，每個質(zhì)量濃度組設(shè)5 個復孔。

1.3.3 H2O2誘導HaCaT細胞氧化損傷模型的建立

參考文獻[23]建立H2O2誘導的HaCaT細胞氧化損傷模型。將H2O2稀釋成2、5、10、15、20、30、40、50、60 μmol/L 9 個濃度組，每個濃度組設(shè)5 個復孔。

1.3.4 黃酮對H2O2誘導的細胞氧化損傷的預保護作用

在1.3.2節(jié)實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，篩選出5 個質(zhì)量濃度的黃酮類物質(zhì)對HaCaT細胞進行預保護，再加入最佳濃度H2O2誘導損傷，考察黃酮對HaCaT細胞氧化損傷的預保護作用。

1.3.5 MTT實驗

從－18 ℃冰箱中取出已配制好的MTT溶液，置于37 ℃水浴。自培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，向每孔加入20 μL MTT溶液，避光，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。每孔加入150 μL的DMSO，置于振蕩器上振蕩5 min后，于酶標儀上讀數(shù)，波長為490 nm。按式（1）計算細胞相對存活率。

1.3.6 DCFH-DA熒光探針染色實驗

采 用2’,7’-二 氯 熒 光 黃 雙 乙 酸 鹽 （ 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）標記法[24]。按照體積比1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其工作液終濃度為10 μmol/L。去除細胞培養(yǎng)液，消化離心（1 000 r/min、5～10 min），收集細胞，加1 mL DCFH-DA工作液，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20?min。孵育后用PBS洗兩次，充分去除細胞外DCFH-DA以降低背景熒光的干擾，于1 000 r/min離心5 min，收集沉淀，用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm處測定熒光強度。

1.3.7 SOD活力測定

1.3.7.1 BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度

用與待測蛋白樣品一致的稀釋液稀釋牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）得到標準品，計算BCA工作液總量，根據(jù)計算出的BCA工作液需要量，將BCA-A和BCA-B兩種試劑按照50∶1的體積比配制BCA工作液。將稀釋好的BSA標準品和待測蛋白樣品各25 μL分別加到做好標記的96 孔板微孔中，每孔加入200 μL BCA工作液，充分混勻，蓋上96 孔板蓋，37 ℃孵育30 min，冷卻至室溫，用酶標儀在562 nm波長處測定每個樣品及BSA標準品的OD值，繪制標準曲線。由標準曲線計算樣品中蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.7.2 SOD活力的測定

將細胞懸液置于－80 ℃冷凍30 min后，37 ℃水浴5 min，按此操作反復凍融細胞4 次，以充分破壞細胞并使其釋放出細胞SOD活性成分，2 500 r/min離心20 min，小心收集上清液。取樣品溶液加入96 孔板中，設(shè)對照孔、對照空白孔、測定孔、測定空白孔4 種。按照SOD試劑盒說明書要求操作，使用酶標儀在波長490 nm處讀取OD值，并計算SOD抑制率和活力（式（2）、（3））。

1.3.8 ROS水平的測定

按照體積比1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。去除細胞培養(yǎng)液，加入適當體積（以能充分蓋住細胞為宜）稀釋好的DCFH-DA。37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，用胰酶消化并收集于流式細胞儀觀察檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Origin軟件制圖，運用SAS 9.0統(tǒng)計軟件進行分析。滿足正態(tài)性分布且方差齊的兩組之間差異的比較用兩組獨立樣本的t檢驗，多組之間差異的比較用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮及VC質(zhì)量濃度篩選結(jié)果

2.1.1 黃酮質(zhì)量濃度的篩選結(jié)果

圖1 不同質(zhì)量濃度黃酮對HaCaT細胞活性的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of A. arguta flavonoids on the viability of HaCaT cells

不同質(zhì)量濃度的黃酮對HaCaT細胞活性的影響存在一定的差異。由圖1可知，在0.1～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與空白組（0.0 mg/mL）相比，0.1、0.3、0.4、0.6、0.8 mg/mL的黃酮對細胞活性影響較小，細胞相對存活率均保持在100%左右，所以選擇這5 個黃酮質(zhì)量濃度進一步研究其對H2O2誘導的細胞氧化損傷的預保護作用。

2.1.2 VC質(zhì)量濃度的篩選結(jié)果

不同質(zhì)量濃度的VC對HaCaT細胞生物活性的影響具有一定差異性。由圖2可知，在0.01～0.08 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，與空白組（0.00 mg/mL）相比，0.07 mg/mL VC相對于其他質(zhì)量濃度而言對細胞活性影響最小，細胞相對存活率更接近100%，所以選擇此VC質(zhì)量濃度進一步研究其對H2O2誘導的細胞氧化損傷的預保護作用。

圖2 VC對HaCaT細胞活性的影響Fig. 2 Effect of VC on the viability of HaCaT cells

2.2 H2O2氧化損傷模型的建立結(jié)果

圖3 H2O2對HaCaT細胞活性的影響Fig. 3 Effect of H2O2 on the viability of HaCaT cells

不同濃度的H2O2對HaCaT細胞生物活性的影響有所不同。由圖3可知，在2～15 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著H2O2濃度的增加，細胞活性總體呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，但不明顯。當H2O2濃度達到20 μmol/L時，對細胞造成了一定的損傷，此時細胞相對存活率為80%左右。當H2O2濃度為30 μmol/L時，細胞的損傷率已十分明顯，此時細胞相對存活率小于40%，故選用此濃度誘導HaCaT細胞的氧化損傷模型，以進行進一步的預保護研究。

2.3 黃酮及VC對H2O2氧化損傷模型的預保護作用

圖4 不同質(zhì)量濃度黃酮對H2O2氧化損傷模型的預保護作用Fig. 4 Protective effect of different concentrations of A. arguta flavonoids on H2O2-induced oxidative damage model

在30 μmol/L H2O2誘導的氧化損傷模型中，不同質(zhì)量濃度黃酮及VC對HaCaT細胞的預保護作用存在差異。由圖4可知，當黃酮質(zhì)量濃度分別為0.3、0.6 mg/mL時，對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化損傷的預保護作用最強，其細胞相對存活率均為60%左右。0.07 mg/mL VC產(chǎn)生的預保護效果稍強于黃酮，細胞相對存活率達69%左右。選擇黃酮物質(zhì)量濃度0.3、0.6 mg/mL分別作為黃酮低、高質(zhì)量濃度組，與0.07 mg/mL VC組進行后續(xù)的相關(guān)研究。

2.4 黃酮及VC對細胞內(nèi)SOD活力的影響

不同處理組間SOD活力表現(xiàn)出較大的差異。如表1所示，當采用30 μmol/L H2O2誘導細胞產(chǎn)生氧化損傷后，SOD活力非常低，大約只有空白對照組SOD活力（10.14 U/mg）的1/3。當加入VC及黃酮對細胞進行預保護后，細胞內(nèi)的SOD活力有所增加，兩者相對于模型組均表現(xiàn)出顯著性差異，其中VC組增加了139.30%，黃酮低質(zhì)量濃度組增加了85.63%，這表明黃酮及VC對H2O2造成的HaCaT氧化損傷有較好的預保護作用，VC抗氧化活性稍強于黃酮。黃酮高質(zhì)量濃度組與黃酮低質(zhì)量濃度組對HaCaT細胞的保護作用不具有顯著性差異，也間接說明較低質(zhì)量濃度黃酮對HaCaT細胞同樣具有較強的抗氧化活性。

表1 H2O2損傷及抗氧化物質(zhì)對細胞內(nèi)SOD活力、ROS水平的影響Table1 Effect of H2O2 damage and antioxidant on intracellular SOD and ROS levels

2.5 黃酮及VC對細胞內(nèi)ROS水平的影響

圖5 細胞ROS測定流式圖Fig. 5 Flow cytometric analysis of ROS in cells

不同處理組間ROS水平同樣表現(xiàn)出較大的差異。由表1、圖5可以看出，用30 μmol/L H2O2誘導氧化損傷模型后，細胞內(nèi)的ROS水平明顯增高，相對于空白對照組（393.56），模型組的ROS水平（677.80）增加了近1 倍；當加入抗氧化物質(zhì)黃酮、VC進行預保護后，細胞內(nèi)的ROS水平較模型組均有一定程度的降低，黃酮高質(zhì)量濃度組降低了12.65%、VC組降低了17.65%，表明黃酮及VC對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化損傷有一定的預保護作用。但相對于空白對照組，黃酮及VC組ROS水平均具有一定程度的升高，從而說明兩者對H2O2誘導的HaCaT細胞氧化損傷的預保護作用并不完全。黃酮對HaCaT細胞的預保護作用稍低于VC，黃酮高質(zhì)量濃度組與黃酮低質(zhì)量濃度組對HaCaT細胞的預保護作用效果相差不大。

3 討 論

本研究以HaCaT細胞為研究對象，以VC作為對照，全面分析了軟棗獼猴桃中黃酮類化合物對H2O2誘導的HaCaT細胞損傷的預保護作用。MTT實驗結(jié)果表明，在樣品實驗質(zhì)量濃度（0.1～1.0 mg/mL）范圍內(nèi)，0.3、0.6 mg/mL的黃酮及0.07 mg/mL的VC對HaCaT細胞影響較小，且這兩個質(zhì)量濃度的黃酮對細胞抗氧化活性的保護效果最好，相對于模型組（H2O2處理組），細胞相對存活率均提高了20%左右，略低于VC組。黃酮高、低質(zhì)量濃度組對細胞抗氧化能力的影響差異小于3%，說明較低質(zhì)量濃度黃酮（0.3 mg/mL）對細胞依然具有較強的抗氧化作用。在ROS水平檢測實驗中，高質(zhì)量濃度組黃酮及VC可有效地降低細胞中ROS水平，相對于模型組，其ROS水平分別降低了12.65%、17.65%；在SOD活力檢測實驗中，黃酮低質(zhì)量濃度組及VC可有效地增加細胞中SOD的活力，相對于模型組，SOD的活力分別增加了85.63%、139.30%。這表明黃酮及VC對H2O2誘導的氧化損傷有一定的預保護作用。這與高揚[12]、步犁[25]等研究的利用HaCaT細胞和原代人皮膚成纖維細胞篩選抗氧化物質(zhì)的結(jié)果大致相似。

本研究結(jié)果表明，黃酮對HaCaT細胞具有一定的抗氧化預保護作用，軟棗獼猴桃中黃酮類物質(zhì)具有較好的抗氧化活性?？寡趸钚缘脑u價方法包括傳統(tǒng)的化學方法、細胞方法、動物模型法和人體志愿者法[26]。目前以細胞為基礎(chǔ)的篩選模型在天然產(chǎn)物抗氧化活性評價研究中逐步得到應用，其中人體皮膚細胞常被選用為測試對象，以經(jīng)氧化損傷誘導后抗氧化物質(zhì)清除體內(nèi)自由基的能力來評價其抗氧化活性的強弱[27-28]。細胞法可以對氧化應激所造成的損傷進行分子水平的分析，對于抗氧化物質(zhì)的評價也更接近人體環(huán)境[29-30]。軟棗獼猴桃中黃酮提取物是一種較強的氧化損傷保護劑，本研究為今后相關(guān)天然抗氧化性保健食品的開發(fā)和利用提供了一定的理論依據(jù)。但本研究結(jié)果仍處于細胞水平，尚且不能全面反映藥物在人體內(nèi)的吸收代謝過程，后續(xù)可通過動物實驗及相關(guān)的藥理學、藥效實驗，進一步推斷其具體的抗氧化活性損傷體內(nèi)保護機制。