姜速峰，趙謀明，江虹銳,，劉小玲，白 洋

（1.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西 南寧 530004；2.廣西嘉盈生物科技有限公司，廣西 南寧 530000）

膠原是脊椎動物中最豐富的蛋白質(zhì)，占脊椎動物總蛋白質(zhì)的25%[1]。一些膠原肽已被證明具有很好的生物學活性，如美白[2]、抗氧化[3]、增加骨密度[4]和降低血壓[5]等，含膠原產(chǎn)品已被廣泛應用于食品、制藥等多個行業(yè)[1]。近幾年來，我國羅非魚的產(chǎn)量穩(wěn)步增加，其加工魚片在水產(chǎn)品出口市場中占主要地位[6]，越來越多的研究關注于羅非魚皮、魚骨等副產(chǎn)物中膠原蛋白或肽的提取工藝及活性研究。莊永亮等[7]研究表明羅非魚皮經(jīng)中性酶與堿性酶法制備的膠原蛋白水解液有很強的羥自由基清除能力，并發(fā)現(xiàn)水解液中的抗氧化性肽段主要由甘氨酸、亮氨酸、谷氨酸組成。Ngo[8]和Sun Liping[9]等也證實羅非魚膠原酶水解物具有很好的清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基的能力。

膠原蛋白、膠原肽對皮膚損傷或生長也有促進作用。Pati等[10]研究發(fā)現(xiàn)南亞野鯪魚鱗膠原蛋白制備的骨架對成纖維細胞具有很好的生長促進作用；Tanaka[11]和Yaar[12]等的研究也發(fā)現(xiàn)羅非魚鱗膠原產(chǎn)品對治愈紫外誘導的皮膚損傷具有一定的有利作用；陳俊等[13]的研究發(fā)現(xiàn)羅非魚皮膠原酶解物和鯊魚皮酶解物具有可以替代谷胱甘肽在化妝品領域應用的潛力，同時膠原酶解物通過分離純化之后有良好的促進表皮細胞生長的能力。人永生化表皮細胞屬于成人表皮細胞自發(fā)轉化而來的細胞系，它與人體正常的角質(zhì)形成細胞有相同的增殖、分化特性和遺傳穩(wěn)定性[14]，常被用于生物醫(yī)學領域，作為體外研究的細胞系，比如皮膚修復愈合和防曬等[15]研究。Zhao Xin[16]和Zhou Tian[17]等以人皮膚角質(zhì)HaCaT細胞作為研究對象，研究明膠、膠原對上皮細胞增殖分化的影響，結果發(fā)現(xiàn)HaCaT細胞在明膠與膠原基質(zhì)上具有良好的生長能力，且能大量表達細胞增殖分化黏附相關因子。但是，關于羅非魚皮肽的抗氧化作用與促進上皮角質(zhì)細胞的傷口愈合及生長相關性的研究很少報道。本研究利用下腳料羅非魚皮酶解物及膜分離組分，探討其體外抗氧化活性對人HaCat細胞生長和人上皮傷口愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚皮 廣西百洋食品有限公司；HaCaT細胞上海中喬新舟生物科技有限公司；中性酶、堿性酶、胃蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基 以色列BI公司；胰酶消化液、雙抗上海碧云天生物技術有限公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT） 北京索萊寶科技有限公司；DPPH 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

722型分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；細胞培養(yǎng)箱 德國BINDER公司；倒置顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司；酶標儀 帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；低速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；超濾裝置 上海摩速科技有限公司；紫外-可見光分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅非魚皮膠原酶解物的制備

羅非魚皮經(jīng)脫色、脫脂、酸法[18]制備得膠原蛋白液，用堿性蛋白酶（alkaline enzyme，AE）、中性蛋白酶（neutral enzyme，NE）、胰蛋白酶（pancreatin enzyme，PE）分別對其酶解，相應得到酶解物AEH、NEH和PEH。各酶解條件如下：2%（質(zhì)量分數(shù)，下同）AE（1×106U/g），溫度55 ℃，pH 9.0；2.5% NE（2×105U/g），溫度55 ℃，pH 7.0；0.2% PE（4×103U/g），溫度50 ℃，pH 8.0；酶解時間1～180 min，所得酶解液經(jīng)沸水浴滅酶10 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液。經(jīng)真空濃縮和冷凍干燥得到AEH、NEH和PEH，將各酶解物蛋白質(zhì)量濃度調(diào)為10、25、50、75、100、150 mg/mL備用。

1.3.2 DPPH自由基清除能力測定

羅非魚皮膠原蛋白酶解，每30 min測定各酶解物清除DPPH的能力，參考張玉等[19]的方法，取2 mL羅非魚皮酶解物于試管中，加入2 mL 0.04 g/L的DPPH無水乙醇溶液，混合均勻，在室溫下暗處理20 min，于517 nm波長處測其吸光度，記為Ai；取2 mL待測樣品于試管中，再加入2 mL無水乙醇，混合均勻，在室溫下暗處理20 min，于517 nm波長處測其吸光度，記為Aj；取2 mL 0.04 g/L的DPPH無水乙醇溶液，加入2 mL無水乙醇，混合均勻，在室溫下暗處理20 min，于517 nm波長處測其吸光度，記為A0。根據(jù)式（1）計算DPPH自由基清除率。

1.3.3 細胞增殖作用分析

采用MTT法[20]分析NEH、AEH、PEH對HaCat細胞生長的影響。在96 孔板中接種HaCat細胞的密度為3×103個/孔，總體積180 μL，6 h細胞貼壁后，各孔中加入10 μL質(zhì)量濃度分別為10、25、50、75、100、150 mg/mL的NEH、AEH、PEH，培養(yǎng)12、24、36、48 h。在檢測前4 h時每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL）孵育，檢測前棄上清液，加入110 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，酶標儀檢測490 nm波長處OD值，記為OD實驗組。以不添加酶解物的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)不同時間后得到的OD值為對照，記為OD對照組，根據(jù)式（2）計算細胞增殖率，繪制細胞增殖曲線。

式中：OD空白為含有不同質(zhì)量濃度酶解物培養(yǎng)基在490 nm波長處的OD值；OD零孔為細胞培養(yǎng)基在490 nm波長處的OD值。

1.3.4 膜分離

對NEH、AEH、PEH 3 種酶解物作用于HaCat細胞，檢測其細胞增殖作用與DPPH自由基清除能力，篩選具有最佳活性的酶解物進行超濾膜分離，共分為＜1 ku、1～5 ku、5～10 ku、＞10 ku的4 個組分，并對該4 個組分進行MTT實驗，篩選出促細胞增殖活性最好的一個組分，經(jīng)真空冷凍干燥保存于－20 ℃。

1.3.5 細胞劃痕實驗

經(jīng)膜分離及MTT實驗篩選出的最佳膠原酶解物組分進行HaCat細胞劃痕實驗，體外研究膠原酶解物對皮膚刮傷愈合作用的活性。參照文獻[21]，在96 孔板中接種細胞3×103個/孔，培養(yǎng)12 h后用10 μL槍頭在細胞表面劃出約5 mm的劃痕，磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，去除損傷的細胞，加入含25 mg/mL膠原酶解物組分的無血清培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于0、12、24、36、48 h經(jīng)倒置顯微鏡拍照觀察，將不含膠原肽的無血清培養(yǎng)基作用組設為空白組，測量不同時間HaCaT細胞劃痕處傷口愈合距離，并按式（3）計算傷口愈合率。

式中：Lt為取樣時間點傷口的平均距離/mm；L0為0 h處的傷口平均距離/mm。

1.3.6 氨基酸組成測定

將膜分離后的膠原酶解物組分經(jīng)6 mol/L HCl溶液110 ℃消化22 h，除去鹽酸，經(jīng)超純水定容之后，0.22 μm濾膜過濾后，利用全自動氨基酸分析儀檢測酶解物中的氨基酸組成。

1.3.7 凝膠色譜分析羅非魚皮膠原肽組分

參照文獻[22]，將作用于HaCaT細胞進行劃痕實驗的肽樣品配成10 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后取2 mL過凝膠過濾分離層析系統(tǒng)，層析柱為Sephadex G-25（1.6 cm×40 cm）。用超純水洗脫樣品，流速為1 mL/min，檢測波長為220 nm，洗脫液自動部分收集，并對收集的液體測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析以及作圖采用SPSS 18.0和Origin 8.5軟件。對所有數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 膠原蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力

圖1 TSCH清除DPPH自由基能力與酶解時間的關系Fig. 1 Scavenging effect of TSCH on DPPH free radical as a function of hydrolysis time

由圖1可以看出，羅非魚皮膠原酶解物對DPPH自由基的清除能力具有時間依賴性，隨著酶解時間的延長，NEH、AEH、PEH的DPPH自由基清除能力也升高，但酶解120～150 min后，各酶解物的DPPH自由基清除能力不再明顯升高。陳日春[23]研究酶解時間與酶解物清除DPPH自由基能力，發(fā)現(xiàn)當酶解到達一定程度，酶解物清除DPPH自由基的能力不再升高，與本研究結果一致。圖1中各酶解物清除DPPH自由基能力從高到低依次是：NEH＞AEH＞PEH，分別在酶解150、120、150 min時達到最大，在各酶解物清除DPPH自由基能力達到最大時，NEH與另外兩種酶解物有顯著性差異（P＜0.05），這與林金鶯[24]研究酶解種類與清除DPPH自由基能力之間的關系中，發(fā)現(xiàn)的AEH清除DPPH自由基能力要高于NEH稍有不同，可能是由于酶解底物的氨基酸殘基序列與組成不同，經(jīng)過特異性酶解后，不同的特異性酶切位點會直接影響酶解產(chǎn)物中肽的分子質(zhì)量和氨基酸組成。此外，Kim等[25]的研究證實膠原酶解物的抗氧化活性與增強細胞活性之間有相關關系，因此本實驗根據(jù)膠原蛋白酶解時間與抗氧化活性的相關性，分別選擇酶解150 min的NEH、酶解120 min的AEH、酶解150 min的PEH為研究對象進行后續(xù)研究。

2.2 細胞增殖作用分析

圖2 不同質(zhì)量濃度NEH（A）、AEH（B）、PEH（C）對HaCaT細胞的增殖作用Fig. 2 Effects of NEH (A), AEH (B) and PEH (C) on the growth stimulation of HaCaT cells at different concentrations and treatment periods

由圖2可知，NEH、AEH和PEH對HaCat細胞的增殖作用隨著作用時間的延長呈現(xiàn)先增后減的趨勢，與Wang Yaowen等[26]報道絲裂霉素作用HaCaT細胞生長規(guī)律類似，同時也與Ohara等[27]研究Pro-Hyp二肽作用成纖維細胞生長作用規(guī)律相同，在細胞生長潛伏期，膠原肽對細胞生長不會產(chǎn)生明顯影響，當細胞進入對數(shù)生長期，膠原肽會顯著促進細胞增殖。同時由圖2可知，NEH、AEH和PEH促進細胞增殖的最佳作用時長為24 h，進一步說明細胞在24 h之內(nèi)經(jīng)歷了從潛伏期到生長期的變化。

圖3 作用24 h后酶解物質(zhì)量濃度對HaCaT細胞的作用Fig. 3 Effects of enzymatic hydrolysates at different concentrations on the proliferation of HaCaT cells after 24 h

由圖3可知，隨NEH、AEH和PEH質(zhì)量濃度增加，促細胞增殖活性也呈現(xiàn)先增后減的趨勢，這可能是低質(zhì)量濃度（5～20 mg/mL）酶解物對細胞無作用，而高質(zhì)量濃度酶解物導致細胞滲透壓增大，破壞細胞原有穩(wěn)定的生存環(huán)境，對細胞產(chǎn)生毒性。這與Chung等[28]研究綠茶提取物對HaCaT細胞生長作用時，中、低質(zhì)量濃度提取物促進細胞生長明顯，高質(zhì)量濃度反而會抑制細胞生長趨勢類似。此外，圖3中酶解物質(zhì)量濃度為10～150 mg/mL時，NEH、AEH和PEH促細胞增殖活性規(guī)律大致相似，作用效果依次為：NEH＞AEH＞PEH，75 mg/mL NEH對細胞的增殖活性最大，與AEH、PEH的最大增殖活性有顯著性差異（P＜0.05）。各酶解物MTT實驗結果與DPPH自由基清除實驗結果呈正相關，說明羅非魚皮膠原蛋白水解物的體外抗氧化活性與促進細胞增殖能力之間可能有正相關關系。相比于另外兩種酶解物，NEH具有最高的細胞增殖活性與抗氧化活性。

圖4 膜分離NEH不同組分與質(zhì)量濃度對HaCaT細胞的作用Fig. 4 Effects of peptide fractions from NEH at different concentrations on HaCaT cells

如圖4所示，隨酶解物質(zhì)量濃度增加，膜截留得到的4 個組分的NEH對HaCaT細胞的增殖作用呈現(xiàn)先增強后減弱趨勢，但其活性均高于未經(jīng)膜分離NEH，這說明超濾膜截留不同分子質(zhì)量的膠原肽酶解物富集了細胞增殖活性組分，1～5 ku組分促進細胞增殖作用最為突出，質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，細胞的增殖率達到（129.37±0.03）%，而＜1 ku、5～10 ku、＞10 ku的組分在質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，對細胞的增殖作用最大，其增殖率分別為（123.40±0.03）%、（122.84±0.02）%、（117.40±0.04）%，但其增殖作用顯著小于1～5 ku。結果說明1～5 ku組分表現(xiàn)出優(yōu)越的促HaCaT細胞增殖能力，陳日春[23]證實鰱魚魚鱗膠原肽分子質(zhì)量在1～5 ku的組分表現(xiàn)出較強的清除DPPH能力，而Kim[29]和Mendis[30]等的研究也發(fā)現(xiàn)阿拉斯加鱈魚皮膠原酶解物的抗氧化活性與增強細胞活性之間有相關關系，即體外抗氧化活性越高，促進細胞增殖作用表現(xiàn)得越大。因此，綜合本實驗結果與其他相關研究，體外抗氧化活性與促進細胞增殖之間呈正相關。為了進一步驗證膜分離NEH獲得的1～5 ku組分的細胞活性，以下細胞劃痕實驗選擇25 mg/mL進行分析。

2.3 細胞劃痕實驗結果

HaCaT細胞經(jīng)NEH（分子質(zhì)量1～5 ku）作用12、24、36、48 h的遷移狀況如圖5所示。

圖5 分子質(zhì)量1～5 ku膠原肽在不同時間對HaCaT細胞遷移的影響Fig. 5 Effects of collagen peptides on the migration of HaCaT cells at different treatment periods

研究細胞的遷移能力時，體外細胞劃痕實驗能在很大程度上模擬體內(nèi)細胞生長遷移過程[31]。上皮細胞生長與增殖過程本質(zhì)是創(chuàng)傷愈合過程。圖5顯示，實驗組和空白組HaCaT細胞在劃痕處傷口中的遷移速率與時間存在相關關系，即隨培養(yǎng)時間延長，劃痕處傷口間距離也相對應縮短。

圖6 分子質(zhì)量1～5 ku膠原肽在不同時間對HaCaT細胞遷移中傷口愈合的影響Fig. 6 Effects of collagen peptides on the wound healing and migration of HaCaT cells at different treatment periods

圖6 顯示，培養(yǎng)24 h，實驗組劃痕處傷口愈合率（81.10±5.04）%與36 h傷口愈合率（81.22±5.77）%、48 h傷口愈合率（84.47±2.34）%劃痕處傷口愈合率已無顯著性差異（P＞0.05），這與之前膠原酶解物最佳作用HaCaT細胞時間24 h相符，而與12 h劃痕處傷口愈合率（54.62±6.88）%存在顯著性差異（P＜0.05），這說明添加膠原肽能使HaCat細胞劃痕處傷口24 h內(nèi)基本愈合完全。與實驗組不同，未添加膠原肽的空白組，在培養(yǎng)時長36 h，劃痕處傷口愈合率（78.54±2.23）%與48 h劃痕處傷口愈合率（80.98±3.32）%無顯著性差異（P＞0.05），而與24 h劃痕處傷口愈合率（62.93±6.33）%存在顯著性差異（P＜0.05），這說明未加膠原肽的空白組HaCaT細胞劃痕處傷口需36 h基本愈合完全，比實驗組劃痕處傷口愈合遲12 h。圖6同時還顯示，培養(yǎng)12 h，實驗組劃痕處傷口愈合率（54.62±6.88）%與空白組劃痕處傷口愈合率（35.48±9.40）%有著極顯著性差異（P＜0.01），在24 h處也同樣如此。因此結果表明，實驗制備的膠原肽對HaCaT細胞劃痕處實驗傷口愈合有很大促進作用。Haapasalmi等[32]報道，細胞表面有一種整合蛋白，在人和動物的傷口處會大量分布，特別是含β1的整合蛋白會在傷口處高表達，整合素作為一種細胞外基質(zhì)的受體，與胞外配體結合，從而啟動信號通路來促進細胞的生長。細胞與胞外基質(zhì)之間的相互作用會很大程度的控制細胞的生長[33]，因此，膠原肽能促進傷口快速愈合，可能與這種調(diào)控機制有關。

2.4 凝膠色譜分析

圖7 Sephadex G-25分離NEHFig. 7 Column chromatography separation of NEH on Sephadex G-25

如圖7所示，對分子質(zhì)量1～5 ku的NEH進行凝膠層析分離，在220 nm波長處檢測，得到2 個洗脫峰，分別在12、23 min左右出峰，且在23 min時的吸光度最大。因此，1～5 ku組分對HaCaT細胞生長與劃痕處傷口愈合效果很可能與23 min分離的組分緊密相關，而這有待進一步的研究。

2.5 氨基酸組成分析

以上實驗表明膠原肽促進HaCaT細胞增殖很可能與其含有抗氧化氨基酸有關。由表1可知，膜分離NEH 4 個組分的甘氨酸與脯氨酸質(zhì)量分數(shù)最高，這主要來源于羅非魚皮膠原中的Gly-X-Y結構；因此，甘氨酸與脯氨酸質(zhì)量分數(shù)最高[18]。同時，表1中顯示1～5 ku的肽段中，苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸的質(zhì)量分數(shù)都顯著性高于其他3 種肽段（P＜0.05），膜分離NEH組分的細胞實驗結果顯示，分子質(zhì)量在1～5 ku的肽段促進HaCaT細胞增殖效果最好，這可能與該肽中上述幾種氨基酸的高質(zhì)量分數(shù)有關。Liu Dasong等[34]的研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸、脯氨酸以及亮氨酸出現(xiàn)在肽鏈C端，而組氨酸出現(xiàn)在N端時都表現(xiàn)出高效清除氧自由基活性，并且含酪氨酸的肽具有高的抗氧化活性，究其原因，酪氨酸具有酚基，作為氫供體終止自由基誘導的鏈式反應。同時林金鶯[24]的研究報道堿性氨基酸中的賴氨酸和精氨酸可與不飽和脂肪酸進行反應生成鹽，從而抑制脂氧化，表現(xiàn)出好的抗氧化特性，進一步研究發(fā)現(xiàn)含組氨酸的肽一般都表現(xiàn)出高抗氧化活性。陳俊等[13]的研究表明，羅非魚皮膠原肽對HaCaT細胞生長和增殖有促進作用，而主要原因是魚皮膠原肽具有高的抗氧化活性，通過增強細胞活性從而防止氧化誘導的細胞死亡，而其中起抗氧化關鍵作用的氨基酸是甘氨酸-酪氨酸。祝婧[35]證實魚膠原肽中苯丙氨酸和賴氨酸是影響成纖維細胞生長增殖的主要因素之一；李喜艷等[36]也報道賴氨酸對奶牛乳腺上皮細胞增殖起促進作用。因此，相比于膜分離NEH中的其他3 個組分，1～5 ku組分對細胞生長起到良好促進作用，其抗氧化氨基酸亮氨酸（3.35%）、酪氨酸（1.49%）、苯丙氨酸（3.41%）、賴氨酸（4.50%）、組氨酸（1.17%）、精氨酸（10.51%）的質(zhì)量分數(shù)顯著高于其他組分，對HaCaT細胞生長和傷口愈合起重要作用。由于氨基酸序列也會在一定程度上影響細胞活性，本研究中分子質(zhì)量1～5 ku組分含有兩組肽成分，其氨基酸組成對抗氧化活性及細胞增殖作用的影響有待進一步研究。

表1 NEH各肽段的氨基酸質(zhì)量分數(shù)Table1 Amino acid composition of NEH%

3 結 論

本實驗研究了羅非魚皮膠原酶解物對HaCaT細胞增殖的影響，并對膠原酶解物的抗氧化活性與促進細胞生長之間關系進行了探討。結果表明，NEH有較高的體外抗氧化活性與促進HaCaT細胞增殖能力，膜分離NEH獲得的1～5 ku組分促進HaCaT細胞生長最顯著，并能在24 h內(nèi)促進HaCaT細胞劃痕處傷口愈合。經(jīng)氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，NEH（分子質(zhì)量1～5 ku）組分抗氧化氨基酸質(zhì)量分數(shù)高于小于1 ku、5～10 ku和大于10 ku組分，羅非魚皮膠原肽促進上皮細胞的生長機制可能其抗氧化活性有關。