姜 爽，徐婧瑤，蘇 鑫，劉 智，宋 伍,

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021）

山慈菇為藥食同源植物，是蘭科植物獨(dú)蒜蘭、云南獨(dú)蒜蘭或杜鵑蘭的干燥假鱗莖，其味甘、微辛、性寒，歸肝、脾經(jīng)，具有化痰散結(jié)、清熱解毒之功效[1]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，山慈菇的主要活性成分包括聯(lián)芐類、菲類、黃烷類、木脂素類及苷類，其藥理作用涉及抗腫瘤、抗菌、降壓、抗血管生成及對(duì)乙酰膽堿受體M3的阻斷作用等[2]。關(guān)于山慈菇多糖（Pseudobulbus cremastrae seu pleiones polysaccharide，PCSPP）的活性研究較少，有研究表明，PCSPP具有抑制荷H22肝癌小鼠的腫瘤生長(zhǎng)作用，該作用與其使Bcl-2表達(dá)減少進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[3]。在多種植物多糖的免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用已被證實(shí)[4-7]，傳統(tǒng)中醫(yī)多應(yīng)用山慈菇水提取物治療癌癥，本研究將著重探討PCSPP的免疫調(diào)節(jié)及抑制小鼠骨肉瘤細(xì)胞S180在體內(nèi)生長(zhǎng)的作用，為進(jìn)一步研究和開發(fā)PCSPP提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

C57BL/6J小鼠，18～22 g，購(gòu)于北京維通利華公司，雌雄各半，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0016。

小鼠骨肉瘤細(xì)胞S180購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，并定期進(jìn)行腹腔接種傳代。

PCSPP（純度＞85%，批號(hào)：20140706） 西安一文生物科技有限公司；小牛血清 杭州四季青生物工程材料研究所；環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、刀豆蛋白（concanavalin A，Con A）、細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 美國(guó)Sigma公司；抗小鼠CD4＋（FITC標(biāo)記）和CD8＋（PE標(biāo)記）抗體 美國(guó)eBioscience公司；白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）檢測(cè)試劑盒 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；BCM-1000型生物潔凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司；FA1004N型電子天平 上海精天電子儀器廠；TGL-16G型低溫臺(tái)式高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)

取正常小鼠，頸椎脫臼法處死后，無(wú)菌操作摘取小鼠脾臟，置于預(yù)冷的含1%胎牛血清的R/MINI-1640培養(yǎng)液中，小心剪去脂肪和結(jié)締組織；用無(wú)菌注射器芯將脾臟擠壓通過200 目篩，獲得單個(gè)細(xì)胞。沿離心管壁緩慢加入4 倍體積的紅細(xì)胞裂解液，在冰浴中裂解5～10 min，1 500 r/min離心10 min；Hank’s液漂洗后，加入5 倍體積含有10%胎牛血清的R/MINI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)（0.4%）染色確保細(xì)胞活度大于95%后，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL。每孔100 μL，加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞為1×106個(gè)。設(shè)空白對(duì)照（生理鹽水）組、PCSPP低、中、高劑量（150、300、600 μg/mL）組、Con A（5 μg/mL）和LPS（10 μg/mL）陽(yáng)性對(duì)照組，每組3 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在492 nm波長(zhǎng)處采用噻唑藍(lán)法測(cè)吸光度，根據(jù)公式（1）計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖刺激率。

1.3.2 小鼠脾巨噬細(xì)胞活性測(cè)定

取荷瘤小鼠，頸椎脫臼法處死后，無(wú)菌操作摘取小鼠脾臟，置于預(yù)冷的含1%胎牛血清的R/MINI-1640培養(yǎng)液中，小心剪去脂肪和結(jié)締組織；用無(wú)菌注射器芯將脾臟擠壓通過200 目篩，獲得單個(gè)細(xì)胞。1 500 r/min離心10 min，去上清液，用含10%小牛血清的R/MINI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，制備約1×108～5×108個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，采用貼壁法純化巨噬細(xì)胞。將純化后的脾巨噬細(xì)胞加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL（1×105個(gè)）。設(shè)空白對(duì)照（生理鹽水）組，PCSPP低、中、高劑量（150、300、600 μg/mL）組，每組3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔吸棄100 μL上清液，加入100 μL中性紅；繼續(xù)培養(yǎng)30 min，1 500 r/min離心10 min，棄掉上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）反復(fù)沖洗3 次，加入200 μL裂解液室溫放置過夜，在589 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，根據(jù)公式（2）計(jì)算吞噬率。

1.3.3 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

取50 只C57BL/6J小鼠，每只注射0.2 mL（1×107個(gè)/mL）S180細(xì)胞懸液于右前肢腋窩下。注射24 h后將小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只，即模型組，PCSPP低、中、高劑量（150、300、600 mg/kg）組，CTX（25 mg/kg）組。腹腔注射給藥，每日1 次，給藥21 d，注射體積均為0.2 mL，模型組給予等體積生理鹽水。末次給藥后24 h，摘眼球取血，制備血清并分裝凍存。小鼠采用頸椎脫臼法處死，取瘤塊、脾臟和胸腺稱質(zhì)量并計(jì)算腫瘤抑制率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，分別根據(jù)公式（3）～（5）計(jì)算。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)荷瘤小鼠脾細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞亞群

按照1.3.1節(jié)方法制備荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，取100 μL脾淋巴細(xì)胞懸液于1.5 mL離心管中，按照說明書中的操作步驟加入適量抗小鼠CD4＋和抗小鼠CD8＋抗體，充分振蕩混勻后，4 ℃靜置30 min，加入1 mL PBS，離心后棄上清液，再加入0.5 mL PBS，在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 ELISA法檢測(cè)荷瘤小鼠血清中細(xì)胞因子含量

采用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法，按照試劑盒操作手冊(cè)中的實(shí)驗(yàn)步驟，檢測(cè)荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ的表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PCSPP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖刺激率和巨噬細(xì)胞活性的影響

表1 PCSPP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖刺激率的影響（n＝5）Table1 Effect of PCSPP on proliferation stimulation ratio of spleen lymphocytes (n= 5)

表2 PCSPP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬率的影響（n＝ 5）Table2 Effect of PCSPP on phagocytic activity of macrophages (n= 5)

由表1可知，與空白對(duì)照組相比，PCSPP各劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性均呈顯著提高趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），并呈劑量依賴效應(yīng)；同時(shí)，PCSPP對(duì)小鼠脾巨噬細(xì)胞活性也均有一定的促進(jìn)作用，與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表2）；以上結(jié)果表明，PCSPP具有促進(jìn)免疫功能的作用。

2.2 PCSPP對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

表3 PCSPP對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響（n＝10）Table 3Antitumor effects of PCSPP in S180 tumor-bearing mice (n= 10)

由表3可知，CTX對(duì)S180荷瘤小鼠生長(zhǎng)的抑制作用最為明顯，抑制率高達(dá)52.2%；低、中、高劑量組的PCSPP對(duì)S180的生長(zhǎng)也具有明顯抑制作用，其抑制率分別為11.9%、20.9%和25.4%；以上結(jié)果表明，PCSPP對(duì)小鼠骨肉瘤細(xì)胞S180體內(nèi)生長(zhǎng)具有抑制作用，且該作用具有劑量依賴效應(yīng)。

2.3 PCSPP對(duì)S180荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

表4 PCSPP對(duì)S180荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響（n＝ 10）Table4 Effect of PCSPP on spleen index and thymus index in S180 tumor-bearing mice (n= 10)

由表4可知，CTX可以極顯著降低荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)（P＜0.01），而低、中、高劑量組的PCSPP均可以明顯增加荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)（P＜0.05或P＜0.01），表明PCSPP對(duì)S180荷瘤小鼠的免疫器官具有一定的保護(hù)作用。

2.4 PCSPP對(duì)S180荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群CD4＋和CD8＋的影響

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PCSPP對(duì)S180荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群CD4和CD8的影響Fig. 1 Effect of PCSPP on CD4＋ and CD8＋ for T cells subset in S180 tumor-bearing mice by flow cytometry

由圖1、表5可知，給予低、中、高劑量的PCSPP后，各給藥組小鼠CD4＋、CD8＋ T細(xì)胞濃度較模型組均有極顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但CD8＋T細(xì)胞濃度增加幅度要低于CD4＋ T細(xì)胞濃度；同時(shí)，PCSPP各劑量組的CD4＋/CD8＋比值與模型組比較，也呈現(xiàn)極顯著性增加（P＜0.01）；以上結(jié)果進(jìn)一步表明，PCSPP的抗腫瘤作用與免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

表5 PCSPP對(duì)S180荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群CD4和CD8的影響（n＝10）Table5 Effect of PCSPP on CD4 and CD8 for T cells subset in S180 tumor-bearing mice (n= 10)

表5 PCSPP對(duì)S180荷瘤小鼠T細(xì)胞亞群CD4和CD8的影響（n＝10）Table5 Effect of PCSPP on CD4 and CD8 for T cells subset in S180 tumor-bearing mice (n= 10)

?

2.5 PCSPP對(duì)S180荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子的影響

表6 PCSPP對(duì)S180荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子的影響（n＝ 10）Table6 Effect of PCSPP on serum cytokine levels in S180 tumor-bearing mice (n= 10)pg/mL

由表6可知，與模型組相比，CTX組小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平極顯著降低（P＜0.01）；而低、中、高劑量的PCSPP均可以極顯著提高荷瘤小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平（P＜0.01），且具有劑量依賴性；以上結(jié)果表明，PCSPP的抗腫瘤作用可能與IL-2、TNF-α及IFN-γ等細(xì)胞因子的表達(dá)水平提高有關(guān)。

3 討 論

惡性腫瘤的死亡率和發(fā)病率逐年增加，對(duì)人類生命和健康造成嚴(yán)重威脅。目前為止，化療仍是多種惡性腫瘤的主要治療手段，但其選擇性差，且存在嚴(yán)重的毒副作用及耐藥性，臨床效果往往不能令人滿意[8-10]。近年來(lái)，從傳統(tǒng)中藥材中篩選具有腫瘤抑制作用的活性成分或先導(dǎo)化合物越來(lái)越受到抗腫瘤藥物研究人員的重視。迄今為止，來(lái)源于植物的抗腫瘤制劑如紫杉醇、喜樹堿、長(zhǎng)春新堿等已成為多種腫瘤化療的首選，此類藥物已占抗腫瘤藥物市場(chǎng)的30%以上[11-13]。中藥應(yīng)用歷史悠久、資源豐富，從中藥中篩選抗腫瘤先導(dǎo)化合物或有效成分，并開展相關(guān)機(jī)制研究，將具有非常重要的意義。本研究以PCSPP為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)其具有較好的抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用，其在低、中、高劑量下的腫瘤抑制率分別為11.9%、20.9%和25.4%，具有較好的應(yīng)用前景。

機(jī)體免疫防御功能的強(qiáng)弱與抗腫瘤作用密切相關(guān)，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)常作為觀察藥物對(duì)免疫功能影響的重要指標(biāo)[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)低、中、高劑量組的PCSPP均可以使荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯增加，表明其具有保護(hù)S180荷瘤小鼠免疫功能的作用；此外，本研究也發(fā)現(xiàn)PCSPP具有促進(jìn)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞吞噬活性的作用。機(jī)體抗腫瘤免疫的主要機(jī)制以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主，成熟的T細(xì)胞可以分為CD4＋和CD8＋兩個(gè)細(xì)胞亞群，而T細(xì)胞亞群的數(shù)目和比值是評(píng)價(jià)免疫功能狀態(tài)最有價(jià)值的指標(biāo)[16-17]。CD4＋T細(xì)胞可產(chǎn)生大量細(xì)胞因子如IL-2、TNF-α、IFN-γ等，也可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞[18-19]；CD8＋ T細(xì)胞在細(xì)胞因子以及CD4＋ T細(xì)胞的協(xié)同作用下發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用[20-21]。本研究結(jié)果證實(shí)，給予荷瘤小鼠PCSPP后，CD4＋、CD8＋ T細(xì)胞濃度及CD4＋/CD8＋比值與模型組比較，均顯著增加。以上結(jié)果進(jìn)一步表明，PCSPP的抗腫瘤作用與免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

在腫瘤出現(xiàn)時(shí)，機(jī)體通過促使IL-2、TNF-α及IFN-γ等細(xì)胞因子分泌增加，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用[22-23]。IL-2具有輔助抗體生成、促進(jìn)淋巴細(xì)胞有絲分裂和增強(qiáng)對(duì)殺傷細(xì)胞的殺傷功能等生物學(xué)作用，是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的重要成員[24-25]。TNF-α除了能夠和IL-2等細(xì)胞因子相互協(xié)調(diào)發(fā)揮一系列的免疫功能外，還具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、壞死及激活淋巴細(xì)胞因子等多種抗腫瘤活性[26-28]。IFN-γ具有上調(diào)MHC分子的表達(dá)和激活巨噬細(xì)胞等功能，是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞因子[29-30]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTX組S180荷瘤血清中IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平顯著降低，細(xì)胞毒性較強(qiáng)，可以損害機(jī)體的免疫功能；而PCSPP能促進(jìn)IL-2、TNF-α及IFN-γ等細(xì)胞因子水平的表達(dá)。此結(jié)果進(jìn)一步提示，PCSPP的抗腫瘤作用與提高S180荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α及IFN-γ等細(xì)胞因子水平，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力有關(guān)。綜上所述，PCSPP具有明顯的腫瘤抑制作用，其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用與提高免疫能力有關(guān)。