于 偉，張桂芳，宋雪建，甄井龍，遲曉星，王振宇

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學 國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；4.哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程系，黑龍江 哈爾濱 150001）

藍靛果花色苷是一種來源極為廣泛的功能性天然食用色素，20世紀80年代后，基于生物類黃酮化學結構的明確，人們從分子水平上對花色苷類化合物的性質有了深刻的理解[1]。Tsuda等[2]用亞油酸自動氧化系統(tǒng)、脂質體系統(tǒng)、兔血紅細胞膜系統(tǒng)和鼠肝粗粒體系統(tǒng)對矢車菊色素葡萄糖苷和矢車菊色素的抗氧化活性進行實驗，發(fā)現(xiàn)其具有很強的抗氧化活性，從而認識到花色苷類化合物的性質和應用都根源于其獨特的化學結構?；ㄉ盏姆恿u基結構對活性氧等自由基有很強的捕捉能力[2-8]?；ㄉ疹惢衔锿ㄟ^清除自由基能對自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護作用，維持細胞膜的流動性和蛋白質的構型構象，具有明顯的抑制高血脂、預防心血管病效果[9-11]。從葡萄中提取的花色苷可以有效地降低膽固醇和低密脂蛋白的水平，預防血栓形成，有助于預防心腦血管疾病的發(fā)生[12]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)花色苷還可降低人體總膽固醇（total cholesterol，TC）含量（13%～26%），降低低密度脂蛋白膽固醇含量（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）（21%～33%）[13]，降低肝臟中甘油三酯（triglyceride，TG）含量[14]。

本課題組在前期的研究中通過液相色譜-二級質譜檢測方法對藍靛果花色苷具體組成成分進行分析，發(fā)現(xiàn)藍靛果花色苷發(fā)揮降脂作用的有效成分可能為矢車菊-3-葡萄糖苷，并進行了體內(nèi)降脂實驗，發(fā)現(xiàn)其能有效降低高脂血癥大鼠體內(nèi)LDL水平。目前對于藍靛果花色苷抗氧化及降血脂的分子機制尚不明確，以往對天然產(chǎn)物抑制膽固醇合成機制的研究，只考慮是否對合成的第一步或者限速酶（如HMGCoA還原酶）有抑制作用，很少考慮對膽固醇逆轉錄作用過程中相關因子的作用。那么，藍靛果花色苷降低血脂水平的主要途徑到底是什么？其作用機理又是如何呢？基于以上問題，本實驗主要通過體內(nèi)實驗，利用Western blot和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）研究藍靛果花色苷對高脂血癥大鼠肝臟組織中低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）及膽固醇逆轉運途徑中三磷酸腺苷結合盒轉運體（ATP-binding cassette transporter，ABCG）基因表達的影響。從基因表達水平上探索藍靛果花色苷對膽固醇逆轉運過程中一些重要因子（LDLR、ABCG1及ABCA1）的調控作用，從而闡明藍靛果花色苷降血脂的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

Wistar大鼠由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部提供，許可證編號：SYXK（黑）2011-007。高脂飼料：78.8%（質量分數(shù)，下同）普通飼料、10.0%豬油、10.0%蛋黃粉、0.2%膽酸鈉、1.0%膽固醇。

藍靛果花色苷為本實驗室提取。

EZNA FFPE RNA Kit 美國Bio-Tek公司；DEPC處理水 上海信帆生物有限公司；SYBR Green PCR試劑盒、逆轉錄試劑盒、培養(yǎng)基、血清、雙抗、胰酶 美國Thermo公司；異丙醇、無水乙醇、氯仿 國藥集團藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設備

7300 Real-time PCR儀 美國ABI公司；TG-16M低溫冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；移液槍 法國吉爾森公司；K30旋渦振蕩器 上海青浦滬西儀器廠；PRO200電動勻漿機 德國FLUKO公司；Q-TOF 6530質譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型及分組

參考李迪[15]和熊霜[16]等的實驗方法，選擇2 月齡雄性Wistar大鼠60 只，按體質量隨機分成6 組，每組10 只。其中基礎飼料對照組，給予普通飼料；其余50 只SD大鼠給予高脂飼料，同時每天添加輔食油渣50 g，自由飲食飲水，每10 d稱一次體質量。30 d后，斷尾取血，測血清TC、TG濃度。30 d造模后，實驗性高脂血癥組大鼠TG濃度（（3.476±1.37）mmol/L）顯著高于正常組TG濃度（（1.936±0.532）mmol/L）（P＜0.01）；實驗性高脂血癥組大鼠TC濃度（（2.415±0.278） mmol/L）顯著高于正常組（（1.703±0.477）mmol/L）（P＜0.05），說明高脂飼料喂養(yǎng)的50 只SD大鼠均造模成功。

根據(jù)TC水平將高脂血癥大鼠隨機分為5 組：高脂血癥模型對照組（HFD，1.2 g/（kg·d mb）生理鹽水灌胃）、陽性對照組（10 mg/（kg·d mb）辛伐他汀片灌胃）和藍靛果花色苷低、中、高劑量組（HFD＋L、HFD＋M、HFD＋H，分別給予4.0、40.0、120.0 mg/（kg·d mb）的花色苷灌胃[17]）。基礎飼料對照組（ND，1.2 g/（kg·d mb）生理鹽水灌胃）。

1.3.2 血脂指標測定

每7 d測定大鼠體質量1 次，35 d后，禁食不禁水24 h后斷尾采血、分離血清，分別測定大鼠血清中TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、LDL-C、載脂蛋白A（apolipoprotein A，Apo-A）和載脂蛋白B（Apo-B）的水平。HDL-C測定：清除法[18]；LDL-C測定：清除法[19]；TG測定：甘油磷酸氧化酶（glycerol phosphate oxidase，GPO）-過氧化物酶-抗過氧化物酶（peroxidaseanti-peroxidase，PAP）法[20]；膽固醇測定：膽固醇氧化酶（cholesterol oxidase，CHOD）-PAP法[21]；Apo-A：免疫比濁法[22]；Apo-B測定：免疫比濁法[22]。

1.3.3 RT-PCR檢測LDLR、ABCG1、ABCA1基因表達水平

稱取30 mg肝臟組織，常規(guī)Trizol提取總RNA，進行反轉錄。反應程序為：37 ℃，60 min；85 ℃，5 min；4 ℃，5 min；置于－20 ℃保存。然后將制備好的cDNA進行RT-PCR擴增，反應程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。數(shù)據(jù)采用儀器自帶ABI Prism 7300 SDS軟件分析；數(shù)據(jù)處理采用GraphPad Prism 5.0軟件。

NCBI primer designing tool設計RT-PCR擴增引物，由上海生工生物技術有限公司合成，具體見表1。

表1 RT-PCR引物Table1 Primers used for RT-PCR

1.3.4 Western blot實驗檢測LDLR蛋白表達水平

稱取30 mg大鼠肝臟組織，進行總蛋白抽提。蛋白用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒進行定量，酶標儀測定OD值。利用垂直電泳儀進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白處于濃縮膠時電壓設置為80 V，蛋白進入分離膠之后電壓調至120 V，電泳1 h。然后進行轉膜，即在電轉完畢后，將PVDF膜置于5%的脫脂奶粉（TBST配制）37 ℃中封閉2 h。分別進行一抗和二抗孵育，一抗孵育：封閉結束之后，TBST清洗PVDF膜3 遍，分別加入以下一抗：兔LDLR（1∶200，V/V）、鼠β-actin（1∶5 000，V/V），4 ℃孵育過夜。二抗孵育：一抗孵育結束后，用TBST洗3 遍，鼠抗/兔抗（1∶2 000，V/V）二抗室溫孵育2 h，TBST脫色搖床清洗3 遍。最后 進行免疫檢測：PVDF膜上均勻滴加ECL化學顯色液，發(fā)光強度用ImageQuant LAS 4000mini化學發(fā)光成像檢測儀檢測拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以表示，采用單因素方差Duncan分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 藍靛果花色苷對大鼠體質量的影響

表2 藍靛果花色苷對大鼠體質量的影響（n＝ 10）Table2 Effect of LCA on rat body weight (n= 10)g

由表2可知，ND組大鼠體質量在5 周內(nèi)處于平穩(wěn)狀態(tài)；HFD組大鼠體質量呈上升趨勢，與ND組有顯著性差異（P＜0.01）。灌胃3 周后，HFD＋M組大鼠的體質量下降，與ND組體質量沒有顯著性差異（P＞0.05），與HFD組體質量有極顯著性差異（P＜0.01）。灌胃4 周后，與HFD組比較HFD＋M組差異顯著（P＜0.01）；與ND組比較，HFD＋M組體質量降低，差異顯著（P＜0.05）；與HFD組比較，HFD＋L、HFD＋H組差異顯著（P＜0.05）。灌胃5 周后，與HFD組比較，HFD＋M組差異極顯著（P＜0.01）；與ND組比較HFD＋M組體質量降低，差異顯著（P＜0.05）；與HFD組比較HFD＋L、HFD＋H組差異顯著（P＜0.05）。綜上可知，不同劑量藍靛果花色苷對于大鼠體質量都有一定的作用效果，但最適宜的條件為HFD＋M。

2.2 藍靛果花色苷對大鼠血脂指標的影響

表3 藍靛果花色苷對大鼠血脂水平的影響（n＝10）Table3 Effect of LCA on blood lipid levels in rats (n= 10)

從表3可以看出，灌胃5 周后，TC和TG水平下降，與HFD組相比各劑量組均具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），其中HFD＋M組最為明顯（P＜0.01）。與HFD組相比，各劑量組HDL-C水平均升高，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。與HFD組相比，各劑量組LDL-C水平均降低，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），其中HFD＋M組最為明顯（P＜0.01）。與HFD組相比，各劑量組LDL-C/HDL-C均降低，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），其中HFD＋M、H組更為顯著（P＜0.01）。與HFD組相比，各劑量組Apo-A水平極顯著提高（P＜0.01）。與HFD組相比，各劑量組Apo-B水平也呈降低趨勢（P＜0.05）。綜上可知，花色苷處理后的大鼠各項指標均得到相應的改善，在HFD+M條件下，作用最為明顯。

2.3 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中LDLR、ABCG1、ABCA1基因表達水平的影響

RT-PCR對各指標mRNA檢測結果顯示（表4），經(jīng)藍靛果花色苷干預后，與HFD組比較，HFD＋L（1.69±0.84）、HFD＋M（3.06±1.23）、HFD＋H（3.41±1.18）組LDLR mRNA表達量均顯著性提高（P＜0.05）。與HFD組比較，HFD＋M（3.49±1.35）、HFD＋H（3.32±1.19）組ABCA1 mRNA表達量均提高，具有顯著性差異（P＜0.05）。與HFD組比較，HFD＋L（1.68±0.75）、HFD＋M（3.46±1.76）、HFD＋H（3.51±1.19）組ABCG1 mRNA表達量均提高，具有顯著性差異（P＜0.05）。與ND組比較，各指標在HFD＋M、H均具有極顯著性差異（P＜0.01），而ABCA1在HFD＋L也具有顯著性差異（P＜0.05）。綜上可知，藍靛果花色苷在HFD＋M、H時對LDLR、ABCA1、ABCG1 mRNA有較好的促進效果。

表4 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中LDLR、ABCA1 and ABCG1 mRNA表達水平的影響（n＝10）Table4 Effect of LCA on the gene expression of LDLR, ABCA1 and ABCG1 in livers of rats (n= 10)

2.4 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中LDLR蛋白表達的影響

Western blot檢測大鼠肝臟組織中LDLR蛋白表達水平，結果顯示，經(jīng)過藍靛果花色苷干預后，與HFD組比較，HFD＋L（0.930±0.082）、HFD＋M（1.280±0.087）、HFD＋H（1.450±0.080）組LDLR蛋白水平均提高，且差異顯著（P＜0.05）（圖1），LDLR蛋白表達結果與mRNA一致。

圖1 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中LDLR蛋白表達水平的影響Fig. 1 Effect of LCA on the protein expression of LDLR in livers of rats

3 討 論

LDLR的表達水平與脂質代謝密切相關，人血液中70%的膽固醇由LDL和極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）攜帶，但絕大部分膽固醇結合于LDL中進行轉運和代謝。LDLR對LDL的吞噬和清除是LDL代謝過程中最為關鍵的環(huán)節(jié)，同時血液中約75%的LDL通過肝臟被清除，其中90%是通過LDLR途徑清除的[23]。LDLR是位于細胞表面的跨膜受體，是分子質量約160 kD的糖蛋白，含839個氨基酸殘基。主要功能是參與LDL的代謝過程，血漿中LDL攜帶的膽固醇主要是通過肝細胞LDLR清除，LDLR對LDL的吞噬與清除是LDL代謝過程中最關鍵的環(huán)節(jié)。許多物質在轉錄水平或轉錄后水平均可調控LDLR基因的表達。本課題組前期的研究證實了藍靛果花色苷可降低大鼠血清中LDL-C的水平[17,24]。高脂血癥是引發(fā)冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等的首要危險因素，有研究表明花色苷具有明顯的降低大鼠血漿TC、TG、LDL-C含量，增加HDL-C含量的功能[25-26]，本研究采用藍靛果花色苷進行實驗，從大鼠灌胃后的體質量變化及血脂6 項的變化可以看出，辛伐他汀和花色苷對大鼠的體質量和血脂都有不同程度的影響，均能減輕大鼠體質量，降低大鼠血漿TC、TG、LDL-C含量，增加HDL-C含量；說明花色苷降血脂效果明顯。另外，研究結果進一步顯示在實驗劑量下藍靛果花色苷可明顯增加高脂大鼠肝臟組織中LDLR蛋白和mRNA的表達量，從而降低LDL-C水平，調節(jié)體內(nèi)血脂含量。

Apo-A大部分分布在HDL中，是HDL的最主要載脂蛋白，與血漿HDL水平呈正相關[27-29]。動脈粥樣硬化、糖尿病、高脂蛋白血癥、肝功不足均可導致Apo-A水平的降低[30-32]。本實驗結果顯示藍靛果花色苷能有效升高高脂血癥大鼠血清中Apo-A和HDL的水平，花色苷中、高劑量組效果明顯。Apo-B存在于LDL的表面，與血漿Apo-B、LDL的水平也呈正相關，本研究結果顯示不同劑量的藍靛果花色苷可有效降低大鼠血清LDL-C水平，中劑量組Apo-B水平下降最明顯；提示藍靛果花色苷能對高脂模型大鼠的肝臟功能有很好的保護作用。

ABCG1和ABCA1是ATP結合轉運蛋白家族成員，主要表達于巨噬細胞及各器官的吞噬細胞系統(tǒng)。ABCG1又可以作為轉運體，將巨噬細胞中的膽固醇轉移至成熟型HDL，ABCG1途徑在巨噬細胞膽固醇流出中有重要的地位[33]。ABCG1能增加膽固醇外流，有利于細胞清除多余膽固醇并避免膽固醇在細胞內(nèi)堆積，但其具體機制至今仍不清楚。Freeman等[34]報道，ABCG1不僅在細胞表面調節(jié)膽固醇逆向轉運，還可調控細胞外膽固醇微結構域的產(chǎn)生，在胞外區(qū)域發(fā)揮重要作用。對冠心病患者單核細胞ABCA1反應性的影響已經(jīng)被證實[35-38]，同時有研究顯示膽固醇外流增加有助于減輕動脈粥樣硬化病變程度[39-41]。ABCA1和ABCG1的表達水平與膽固醇流出密切相關，二者分別負責把細胞內(nèi)的脂質轉運至胞外的Apo A-I和HDL，在維持細胞內(nèi)膽固醇的動態(tài)平衡、阻止脂質在巨噬細胞內(nèi)的聚集中發(fā)揮著重要作用[42-44]。本實驗結果顯示40.0、120 mg/（kg·d mb）劑量下的藍靛果花色苷可有效增加高脂大鼠肝臟組織中ABCA1和ABCG1基因表達水平，影響膽固醇逆轉運。

綜上分析，通過對高脂血癥大鼠進行藍靛果花色苷干預，測定血脂水平、肝臟LDLR及其相關基因ABCG1和ABCA1 mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)在本實驗劑量下藍靛果花色苷可有效調節(jié)高脂大鼠體內(nèi)的血脂指標，增加動物體內(nèi)LDLR蛋白和基因的表達水平，降低膽固醇含量，其作用機制可能與其調控膽固醇逆轉運途徑中ATP結合轉運蛋白，從而增加膽固醇外流，調節(jié)膽固醇逆轉運有關。