羅 宏，段翠翠，欒 暢，高 磊，趙玉娟，牛春華，李盛鈺,

（1.長(zhǎng)春大學(xué)特殊教育學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林 長(zhǎng)春 130033）

益生菌是一類對(duì)宿主有益的活性微生物，其定植于腸道中，能夠維持腸道菌群正常生長(zhǎng)代謝，緩解乳糖不耐癥，并具有改善便秘和腹瀉、調(diào)節(jié)血脂代謝、降低過(guò)敏反應(yīng)、提高機(jī)體免疫力等生理功能[1-3]。目前，益生菌潛在的防治糖尿病的功能已得到動(dòng)物體內(nèi)及臨床實(shí)驗(yàn)的證實(shí)和廣泛認(rèn)可。當(dāng)機(jī)體攝入適量的益生菌時(shí)，能有效調(diào)節(jié)能量代謝，降低脂肪和膽固醇堆積，有效補(bǔ)充糖尿病引起的腸道菌群缺失，建立新的腸道平衡穩(wěn)態(tài)，恢復(fù)健康腸道菌群結(jié)構(gòu)，降低腸道滲透性，提高腸道屏障作用，抑制炎癥反應(yīng)，減輕葡萄糖不耐受并提高葡萄糖耐量和胰島素敏感性。例如，干酪乳桿菌干預(yù)糖尿病模型小鼠后，血糖水平顯著下降，可能其通過(guò)保護(hù)或修復(fù)胰島細(xì)胞功能降低胰島損傷，改善血糖代謝異常[4]。高脂膳食誘導(dǎo)的2型糖尿病模型小鼠攝入動(dòng)物雙歧乳桿菌后，減少了腸黏膜中革蘭氏陰性菌的細(xì)菌易位及大腸桿菌的數(shù)量，并降低腸系膜脂肪組織中腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細(xì)胞介素-1β（interleukine-1β，IL-1β）、纖溶酶原激活物抑制劑-1和IL-6水平，改善葡萄糖耐受，提高胰島素敏感性[5]。約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）可減少機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)并增加緊密連接蛋白的表達(dá)，降低糖尿病傾向小鼠的發(fā)病率[6]，另有研究表明約氏乳桿菌可調(diào)節(jié)Th17的表達(dá)，緩解糖尿病的發(fā)生發(fā)展[7]。然而，目前益生菌改善和治療糖尿病的機(jī)理還未深入闡明，可能與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及腸道菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)[8]。

植物乳桿菌C88是從傳統(tǒng)發(fā)酵食品奶豆腐中分離獲得的一株益生菌。研究表明，植物乳桿菌C88具有抗氧化、抗衰老、降膽固醇、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高機(jī)體免疫力和保護(hù)肝損傷等生理功能[9-10]。本研究采用高脂飼料結(jié)合腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立2型糖尿病模型，通過(guò)檢測(cè)灌胃植物乳桿菌C88對(duì)大鼠的血糖、血脂、血清炎癥因子、腸道通透性以及腸道菌群的影響，評(píng)價(jià)植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病大鼠的降血糖作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、菌株、材料與試劑

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠150 只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（吉）-2011-0004?；A(chǔ)飼料：粗蛋白20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、粗脂肪4%、粗纖維5%、粗灰分8%、水分10%、鈣10%、磷1%、賴氨酸1%；高脂飼料：基礎(chǔ)飼料75%、豬油10%、蛋黃粉10%、膽鹽5%。

植物乳桿菌（L. plantarum）C88為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自有菌株，由內(nèi)蒙古奶豆腐中分離獲得，其保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 209254。菌株在添加20%（體積分?jǐn)?shù)）甘油的MRS（de Man, Rogosa and Sharpe，MRS）培養(yǎng)基中于－80 ℃保存。

MRS液體培養(yǎng)基：牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、檸檬酸鈉5 g、無(wú)水乙酸鈉5 g、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·5H2O 0.05 g、吐溫-80 1 mL、葡萄糖20 g，加三級(jí)水定容至1 L，醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.6。115 ℃高壓滅菌15 min。

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 美國(guó)Sigma公司；大鼠血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、脂聯(lián)素（adiponectin，ADPN）、D-乳酸（D-lactic acid，D-Lac）、TNF-α、IL-6、IL-1、IL-1β、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、胰島素（insulin，INS）、胰高血糖素樣肽-2（glucagon like peptide-2，GLP-2）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、連蛋白（zonulin，ZON）等的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒上海朗頓生物技術(shù)有限公司；放射免疫沉淀（radio immunoprecipitation assay，RIPA）蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體、抗核因子-κB（nuclear factor-κ-gene binding，NF-κB）單克隆抗體、兔抗TNF-α單克隆抗體、抗閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）單克隆抗體、兔抗occludin單克隆抗體、兔抗claudin-1單克隆抗體 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Western blot化學(xué)發(fā)光辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）底物 美國(guó)Millipore公司。

LBS（Lactobacillus selection agar）瓊脂培養(yǎng)基、雙歧桿菌瓊脂（MRS＋neomycin nalidixic acid lithium chllloride paromomycin agar，MRS＋NNLP）培養(yǎng)基、腸桿菌計(jì)數(shù)瓊脂（violet red bile dextrose agar，VRBDA）培養(yǎng)基、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂（tryptose sulfite cycloserine agar base，TSC）培養(yǎng)基、膽鹽-七葉苷-疊氮鈉瓊脂（bile esculin azide agar，BEA）培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

卓越型血糖儀 德國(guó)Roche診斷有限公司；Sorvall Evolotion RC型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；Cary300紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；HZQ-Q型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ELx800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；XW-80A渦旋混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；電泳和轉(zhuǎn)印系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；ChemiScope 5600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化和培養(yǎng)

菌株在MRS液體培養(yǎng)基中連續(xù)活化培養(yǎng)3 代，按體積分?jǐn)?shù)3%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，4 ℃、3 800 r/min離心15 min，棄上清液，菌泥用滅菌生理鹽水洗滌2 次，調(diào)整C88菌數(shù)為1010CFU/mL備用[11]。

1.3.2 2型糖尿病大鼠模型建立及分組

圖1 動(dòng)物分組、飼喂及造模Fig. 1 Animal grouping, feeding and modeling

室溫（20±3）℃、12 h晝/夜循環(huán)、自由進(jìn)水、基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)選取35 只SD大鼠作為正常對(duì)照組，飼喂普通飼料；其余115 只大鼠飼喂高脂飼料，連續(xù)飼養(yǎng)8 周（實(shí)驗(yàn)期為第2～9周）后測(cè)定體質(zhì)量，體質(zhì)量增加量超過(guò)空白對(duì)照組平均體質(zhì)量20%選為肥胖模型，排除造模不成功大鼠。肥胖大鼠空腹12 h（實(shí)驗(yàn)期為第9周），一次性腹腔注射30 mg/kg STZ[12]。1 周后（實(shí)驗(yàn)第10周），測(cè)定大鼠空腹血糖濃度，連續(xù)2 次測(cè)定空腹血糖濃度不小于11.1 mmol/L即判定為造成2型糖尿病模型，去除造模不成功大鼠。隨機(jī)選取70 只大鼠分為模型組和C88組（每組35 只），C88組大鼠灌胃12 mL/（kg·d）植物乳桿菌C88（1.0×109CFU/mL），正常對(duì)照組和模型組大鼠灌胃12 mL/（kg·d）無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液，連續(xù)灌胃28 d，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 大鼠體質(zhì)量及空腹血糖含量測(cè)定

從第10周大鼠造成2型糖尿病模型開(kāi)始，治療期間每周測(cè)定大鼠體質(zhì)量，并用血糖儀測(cè)定大鼠空腹血糖濃度[13]。

1.3.3.2 口服葡萄糖耐量測(cè)定

第14周治療結(jié)束后，大鼠空腹12 h，灌胃葡萄糖溶液（2 g/kg）。分別于0、30、60、90、120 min后測(cè)定大鼠血糖濃度，并按照下式計(jì)算血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）[14]。

AUC/（mmol?h/L）＝1/2（G0＋G30）×30＋1/2（G30＋G60）×30＋1/2（G60＋G90）×30＋1/2（G90＋G120）×30

式中：G0、G30、G60、G90、G120分別為0、30、60、90、120 min時(shí)大鼠的血糖濃度/（mmol/L）；30為測(cè)定間隔時(shí)間。

1.3.3.3 大鼠血清指標(biāo)檢測(cè)

口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射1 mL/kg 3%戊巴比妥鈉麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)，一次性采血針心臟采血（約5 mL），血液樣本室溫凝固60 min，3 500 r/min 4 ℃離心15 min，收集上清液分裝，置于－80 ℃冰箱中保存。參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-1β、INS、GLP-2、ADPN、LPS、D-Lac、DAO、ZON水平。

1.3.3.4 大鼠腸道菌群計(jì)數(shù)

分別于實(shí)驗(yàn)期間第10、11、12、13、14周（實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)），每組隨機(jī)取大鼠3 只，脫頸處死，無(wú)菌條件下取大鼠成形腸內(nèi)容物于試管內(nèi)，無(wú)菌生理鹽水梯度稀釋，分別取50 μL涂布于LBS、MRS＋NNLP、VRBDA、BEA、TSC瓊脂平板，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)平行，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，分別檢測(cè)乳桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量。以顯微鏡鏡檢、革蘭氏染色等方法鑒定目的菌落，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[15]。

腸道內(nèi)主要菌群鑒定方法：1）乳桿菌（LBS瓊脂）在37 ℃培養(yǎng)48 h，白色或乳白色革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽孢桿菌；2）雙歧桿菌（MRS＋NNLP瓊脂）在37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，微白色、表面光滑、凸起、革蘭氏陽(yáng)性的叉狀或棒狀菌落；3）腸桿菌（VRBDA瓊脂）在37 ℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵乳糖、革蘭氏陰性的菌落；4）腸球菌（BEA瓊脂）在37 ℃培養(yǎng)24 h，明顯褐色圈、革蘭氏陽(yáng)性的菌落；5）產(chǎn)氣莢膜梭菌（TSC瓊脂）在37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，在紫外光下觀察有熒光的黑色菌落。

1.3.3.5 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死小鼠后取肝臟、回腸組織，預(yù)冷生理鹽水沖洗，迅速放入－80 ℃冰箱凍存。分別取肝臟、回腸組織加入RAPI裂解液充分勻漿（置于冰上），提取總蛋白，參照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度。樣品蛋白變性處理后，用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%牛血清白蛋白封閉2 h，在1∶1 000稀釋的抗體中4 ℃條件下孵育過(guò)夜，0.1% TBST洗膜3 次，每次20 min，再用1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，0.1%TBST洗膜3 次，每次20 min，加入Western blot化學(xué)發(fā)光HRP底物，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。應(yīng)用Clinx Image Analysis圖像分析軟件對(duì)硝酸纖維素膜上的條帶進(jìn)行灰度值比較分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠體質(zhì)量的影響

表1 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠體質(zhì)量的影響（n＝ 20）Table1 Effect of L. plantarum C88 on body weight in rats with type 2 diabetes (n= 20)g

由表1可知，與正常對(duì)照組相比，高脂飼料結(jié)合STZ誘導(dǎo)大鼠糖尿病后明顯增加大鼠體質(zhì)量。治療期間，模型組和C88組大鼠的體質(zhì)量持續(xù)增加，但C88組大鼠體質(zhì)量增加速度緩慢，與模型組相比體質(zhì)量增加量下降，但仍然高于正常對(duì)照組。第12～14周，模型組大鼠每周體質(zhì)量增加量在15.76～17.79 g之間，C88組大鼠每周體質(zhì)量增加量為8.37～13.30 g，第14周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)C88組大鼠體質(zhì)量為514.46 g，與模型組相比差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明灌胃植物乳桿菌C88能明顯抑制2型糖尿病模型大鼠體質(zhì)量的增加。

2.2 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠空腹血糖濃度的影響

如表2所示，第10周模型組和C88組大鼠空腹血糖濃度與正常對(duì)照組相比含量明顯提高，表明高脂飼料結(jié)合STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病模型造模成功。與正常對(duì)照組相比，2型糖尿病大鼠空腹血糖濃度隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。灌胃植物乳桿菌C88一周后（第11周），C88組大鼠空腹血糖濃度明顯下降，血糖濃度降低3.01 mmol/L。第12周C88組大鼠空腹血糖濃度降低至13.55 mmol/L，與模型組相比差異性顯著（P＜0.05）。第13、14周血糖濃度持續(xù)降低，與模型組相比均有極顯著差異（P＜0.05）。治療結(jié)束時(shí)（第14周），C88組大鼠空腹血糖濃度降低至13.25 mmol/L。以上結(jié)果表明，植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病大鼠高血糖癥有治療作用，能顯著降低大鼠的空腹血糖濃度。

表2 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠空腹血糖濃度的影響（n＝ 20）Table2 Effects of L. plantarum C88 on fasting blood glucose levels in rat model of type 2 diabetes (n= 20)mmol/L

2.3 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠口服葡萄糖耐量的影響

圖2 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠口服葡萄糖耐量的影響（n＝20）Fig. 2 Effect of L. plantarum C88 on glucose tolerance in rats with type 2 diabetes (n = 20)

圖3 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠血糖AUC的影響（n＝ 20）Fig. 3 Effect of L. plantarum C88 on area under curve of rats with type 2 diabetes (n = 20)

口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)中，葡萄糖灌胃初始時(shí)（0 min）葡萄糖負(fù)荷為0，C88組大鼠的血糖濃度明顯低于模型組，為模型組的72.64%。葡萄糖負(fù)荷30 min時(shí)，各組大鼠血糖濃度升高達(dá)到峰值，模型組大鼠血糖濃度最高，為28.24 mmol/L，C88組大鼠血糖濃度為20.07 mmol/L，說(shuō)明植物乳桿菌C88改善了糖尿病大鼠的血糖調(diào)控能力。隨著葡萄糖負(fù)荷時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠血糖濃度均呈下降趨勢(shì)，但模型組大鼠的血糖濃度仍在較高的水平。在葡萄糖負(fù)荷60～120 min時(shí)，C88組大鼠血糖濃度持續(xù)降低，90 min和120 min時(shí)血糖濃度與模型組相比有顯著性差異（P＜0.05）或極顯著性差異（P＜0.01）。如圖3所示，與模型組相比C88組血糖AUC降低，具有極顯著性差異（P＜0.01）。結(jié)果說(shuō)明植物乳桿菌C88能有效改善2型糖尿病大鼠的血糖調(diào)節(jié)能力，有效減緩餐后血糖水平迅速升高。

2.4 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度的影響

表3 物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度的影響（n＝20）Table3 Effect of L. plantarumC88 on serum levels of TC, TG, HDL-C and LDL-C in rats with type 2 diabetes (n= 20)mmol/L

2型糖尿病大鼠體內(nèi)血糖代謝異常同時(shí)會(huì)引起血脂代謝紊亂，如表3所示，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠的TC、TG、LDL-C濃度均升高，HDL-C濃度降低。植物乳桿菌C88灌胃可顯著降低糖尿病大鼠血清中TC、TG、LDL-C濃度（P＜0.01或P＜0.05），顯著提高HDL-C濃度（P＜0.05），緩解2型糖尿病大鼠高血脂癥狀，改善血脂代謝紊亂。

2.5 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-1β、CRP的影響

表4 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-1β、CRP質(zhì)量濃度的影響（n＝20）Table4 Effect of L. plantarumC88 on serum levels of TNF-α, IL-1,IL-6, IL-1β and CRP in rats with type 2 diabetes (n= 20)

2型糖尿病引起的葡萄糖和脂質(zhì)代謝紊亂會(huì)誘發(fā)大鼠體內(nèi)慢性炎癥，血清中炎癥標(biāo)志物TNF-α、IL-1、IL-6、IL-1β、CRP水平升高。與模型組相比，治療后C88組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、CRP質(zhì)量濃度均極顯著下降（P＜0.01），基本恢復(fù)到正常對(duì)照組水平。血清中IL-1質(zhì)量濃度降低到50.09 ng/L，與模型組相比有顯著性差異（P＜0.05）。血清中IL-6水平降低到24.10 ng/L，與空白組水平相當(dāng)，與模型組相比有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果表明，植物乳桿菌C88能有效改善2型糖尿病大鼠血清中炎癥標(biāo)志物水平，緩解機(jī)體慢性炎癥狀態(tài)。

2.6 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠血清中INS、GLP-2、ADPN水平的影響

表5 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠血清中INS、GLP-2、ADPN水平的影響（n＝20）Table5 Effect of L. plantarumC88 on serum levels of INS, GLP-2 and ADPN in rats with type 2 diabetes (n= 20)

如表5所示，第14周治療結(jié)束時(shí)，C88組大鼠血清中INS水平恢復(fù)到32.61 mU/L，與模型組相比有極顯著性差異（P＜0.01）。GLP-2質(zhì)量濃度提高到2.14 ng/mL，與模型組相比有顯著性差異（P＜0.05）。ADPN質(zhì)量濃度提高到12.41 ng/mL，與模型組相比差異不明顯（P＞0.05）。結(jié)果表明，植物乳桿菌C88能促進(jìn)胰島素的分泌，提高血清中胰高血糖素樣肽-2、脂聯(lián)素水平。

2.7 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠血清中LPS、D-Lac、DAO、ZON水平的影響

表6 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠血清中LPS、D-Lac、DAO、ZON水平的影響（n＝20）Table6 Effect of L. plantarum C88 on serum levels of LPS, D-Lac,DAO and ZON in rats with type 2 diabetes (n= 20)

2型糖尿病大鼠體內(nèi)胰島素分泌不足導(dǎo)致血清中LPS、D-Lac水平明顯增加，灌胃植物乳桿菌C88 28天后，LPS、D-Lac水平均有顯著降低（P＜0.05）。治療后C88組大鼠血清中DAO質(zhì)量濃度下降到26.43 ng/mL，與模型組相比有極顯著性差異（P＜0.01），ZON質(zhì)量濃度降低到5.93 ng/mL，與模型組相比差異性顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，植物乳桿菌C88能有效調(diào)節(jié)血清中脂多糖、D-Lac水平，降低2型糖尿病大鼠血清中DAO、ZON水平。

2.8 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠腸道菌群的影響

圖4 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠腸道菌群的影響Fig. 4 Effect of L. plantarum C88 on intestinal microflora of rats with type 2 diabetes

圖4 顯示了2型糖尿病大鼠灌胃植物乳桿菌C88后腸道中乳桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌菌體濃度的變化。治療期間，C88組大鼠糞便中乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。到第13～14周，乳桿菌和雙歧桿菌數(shù)量基本恢復(fù)到正常對(duì)照組水平。大鼠腸道中腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌隨著灌胃植物乳桿菌C88時(shí)間的延長(zhǎng)，數(shù)量逐漸下降。第11周時(shí)，C88組大鼠腸道中的腸球菌數(shù)量呈明顯下降趨勢(shì)。第12周時(shí)C88組大鼠腸道中腸球菌數(shù)量明顯降低。到第14周時(shí)，C88組大鼠腸道中腸球菌、腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量基本恢復(fù)到正常對(duì)照組水平。結(jié)果表明，植物乳桿菌C88能緩解2型糖尿病大鼠腸道損傷，平衡腸道微生態(tài)，促進(jìn)有益菌乳桿菌和雙歧桿菌的增殖，抑制有害菌腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)腸道微生態(tài)向健康方向發(fā)展。

2.9 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠蛋白表達(dá)的影響

圖5 植物乳桿菌C88對(duì)2型糖尿病模型大鼠蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of L. plantarum C88 on protein expression in rats with type 2 diabetes

由圖5可知，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟中NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)明顯升高，表明2型糖尿病誘發(fā)了機(jī)體炎癥。與模型組相比，C88組NF-κB、TNF-α蛋白的表達(dá)被不同程度地抑制，表明植物乳桿菌C88可能調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)。由圖5可知，2型糖尿病大鼠回腸中ZO-1、occludin、claudin-1蛋白的表達(dá)量降低，腸道屏障受損，腸道通透性增加。與模型組相比，C88組大鼠回腸中ZO-1、occludin、claudin-1蛋白的表達(dá)量不同程度增加，表明植物乳桿菌C88能夠通過(guò)上調(diào)腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)量，改善腸道屏障損傷。

3 討 論

2型糖尿病是由于胰島分泌功能缺陷、胰島素抵抗等引起的慢性代謝綜合征，主要包括肥胖、高血糖、高胰島素血癥、高脂血癥。研究中采用高脂膳食結(jié)合STZ誘導(dǎo)大鼠2型糖尿病模型[16]，實(shí)驗(yàn)第10周模型組和C88組大鼠空腹血糖量與正常對(duì)照組相比明顯提高，表明成功建立2型糖尿病模型。在實(shí)驗(yàn)第10～14周模型組大鼠體質(zhì)量增加量高于空白對(duì)照組大鼠體質(zhì)量增加量，表明高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖導(dǎo)致2型糖尿病模型大鼠體質(zhì)量持續(xù)增加。植物乳桿菌C88可有效減少2型糖尿病模型大鼠體質(zhì)量的增加，緩解大鼠肥胖狀態(tài)。Huang Huiyu等[17]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌K68抑制高脂肪-果糖誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的體質(zhì)量增加，這與本研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)益生菌主要通過(guò)抑制血清中總膽固醇、甘油三酯等相關(guān)血脂水平的升高，緩解2型糖尿病小鼠胰島素抵抗癥狀[18-19]。隨著灌胃植物乳桿菌C88時(shí)間的延長(zhǎng)，促進(jìn)大鼠體內(nèi)HDL-C的生成，抑制LDL-C的生成，減少膽固醇的沉積，加快肝臟對(duì)脂類的降解，降低脂多糖的活性，減少機(jī)體對(duì)甘油三酯的吸收，緩解2型糖尿病模型大鼠高血脂癥狀。同時(shí)恢復(fù)了血清中脂聯(lián)素水平，有效發(fā)揮胰島素增敏作用，刺激組織對(duì)機(jī)體葡萄糖的攝取，降低空腹血糖濃度，增強(qiáng)葡萄糖耐受，有效減緩餐后血糖水平的迅速升高，緩解2型糖尿病模型大鼠胰島素分泌不足。

2型糖尿病患者因存在胃腸動(dòng)力障礙及高糖高脂的膳食結(jié)構(gòu)等造成革蘭陰性菌異常增殖，產(chǎn)生大量脂多糖，引發(fā)全身慢炎癥反應(yīng)，通過(guò)作用于細(xì)胞膜受體，激活NF-κB通路、c-Jun氨基端激酶通路等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)促炎癥因子及炎癥標(biāo)志物如TNF-α、IL-1、IL-6、CRP、PAI-1等分泌[20-22]。治療結(jié)束后C88組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、CRP含量降低，基本恢復(fù)到正常水平，IL-1、IL-6水平有不同程度降低，肝臟中NF-κB、TNF-α蛋白的表達(dá)被不同程度地抑制。有研究報(bào)道口服羅伊氏乳桿菌GMNL-263改善糖尿病大鼠體內(nèi)TNF-α、IL-6水平[23]，鼠李糖乳桿菌CCFM0528能調(diào)節(jié)2型糖尿病小鼠炎癥因子TNF-α、IL-6，IL-等相關(guān)mRNA的表達(dá)[16]。本研究結(jié)果表明植物乳桿菌C88可能通過(guò)激活2型糖尿病模型大鼠NF-κB信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，下調(diào)炎癥因子及炎癥標(biāo)志物的表達(dá)和釋放而發(fā)揮抗炎作用。

健康狀態(tài)下，腸道菌群與宿主、外界環(huán)境建立起一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，保證各項(xiàng)生理活動(dòng)正常運(yùn)行。植物乳桿菌C88具有較強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽能力，表面黏附蛋白能夠黏附在Caco-2單層細(xì)胞的表面并形成占位，從而阻礙大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附[24]。植物乳桿菌C88可在小鼠盲腸、結(jié)腸、回腸中定植，在小腸黏膜表面呈彌散狀分布，形成生物性占位。攝入植物乳桿菌C88可有效修復(fù)2型糖尿病大鼠失調(diào)的腸道菌群，1.0×109CFU/mL可促進(jìn)雙歧桿菌和乳桿菌數(shù)量增加，降低腸桿菌數(shù)量，調(diào)節(jié)產(chǎn)氣莢膜梭菌和腸球菌數(shù)量恢復(fù)至正常水平。2型糖尿病大鼠連續(xù)灌服植物乳桿菌C88 4 周后，血清中脂多糖、DAO、ZON水平有不同程度的降低，回腸中腸黏膜細(xì)胞間黏附的緊密連接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1的表達(dá)增加。有研究證明益生菌VSL＃3通過(guò)激活p38和ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提高緊密連接蛋白表達(dá)水平，改善腸黏膜屏障功能[25]，大腸桿菌Nissle 1917促進(jìn)小鼠回腸組織ZO-1的mRNA和蛋白的表達(dá)，提高腸上皮屏障的保護(hù)功能[26]，鼠李糖乳桿菌通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，減輕促炎細(xì)胞因子對(duì)腸黏膜屏障的損傷[27]。植物乳桿菌C88可能通過(guò)定植在腸道內(nèi)，提供防御病原菌的天然屏障，修復(fù)或提高腸黏膜防御功能，促進(jìn)2型糖尿病大鼠腸黏膜屏障的完整性，改善腸道通透性。

綜上所述，植物乳桿菌C88通過(guò)調(diào)節(jié)脂類代謝，改善葡萄糖耐受，降低血清炎癥因子水平，恢復(fù)胰島素敏感性，平衡腸道微生態(tài)和修復(fù)腸道屏障功能等降低2型糖尿病模型大鼠的血糖水平。本研究結(jié)果為植物乳桿菌C88開(kāi)發(fā)輔助降血糖功能性食品提供了理論依據(jù)。