皮冰冰，趙 曉，呂萍萍，彭鈺凱，潘 琳，許曉曦,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.綏芬河出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 綏芬河 157300）

嬰兒配方奶粉作為一種母乳替代品[1]，是非母乳喂養(yǎng)嬰兒的首選食物。嬰幼兒配方奶粉的研制，從宏觀到微觀都要求盡可能地接近人乳。目前配方奶粉在營(yíng)養(yǎng)成分上已滿(mǎn)足嬰幼兒的生長(zhǎng)需要[2-4]，但其中缺少能夠提高嬰幼兒免疫能力的免疫活性物質(zhì)[5-6]。人乳鐵蛋白（human lactoferrin，LFH）作為母乳中重要的免疫活性成分，是人乳中主要的蛋白質(zhì)之一，占普通母乳總蛋白含量的10%[7-8]，是嬰兒增強(qiáng)免疫系統(tǒng)能力的重要物質(zhì)[9-10]，是嬰兒配方奶粉“母乳化”的重要指標(biāo)。乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）經(jīng)胃蛋白酶作用會(huì)釋放生物活性物質(zhì)乳鐵蛋白素（lactoferricin，Lfcin）。研究表明，LF與Lfcin在抵抗真菌、炎癥以及病菌感染[11-13]，抗癌及提高機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力促進(jìn)傷口愈合[14-16]等方面具有顯著作用?，F(xiàn)階段包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家均已將LF加到嬰兒配方奶粉中[16-17]，但用量不明確[18-19]，且LFH來(lái)源受限，價(jià)格昂貴，限制了其的添加使用。牛乳鐵蛋白（bovine lactoferrin，LFB）分子質(zhì)量與LFH分子質(zhì)量相近[20-21]，且牛乳鐵蛋白素（bovine lactoferricin，LfcinB）與人乳鐵蛋白素（human lactoferricin，LfcinH）的順序同源性高達(dá)69%[22-23]，LFB原料來(lái)源便捷、價(jià)廉，尤其是小肽LfcinB的生產(chǎn)更節(jié)約成本。如何以低價(jià)等效成分替代母乳活性成分，對(duì)于降低嬰兒配方奶粉中免疫活性物質(zhì)的成本具有重要的意義。本研究以牛乳清乳鐵蛋白（bovine whey lactoferrin，LFW）、牛初乳乳鐵蛋白（bovine colostrum lactoferrin，LFC）與LFH及LfcinB與LfcinH為原料，探究其作用的最佳劑量及相互替代的用量比例關(guān)系，為L(zhǎng)FB替代LFH在配方奶粉中的添加提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

BALB/c小鼠SPF級(jí)雌性6～8 周，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。LFW（產(chǎn)自新西蘭） 北京銀河路經(jīng)貿(mào)有限公司；LFC 黑龍江康普生物科技有限公司；LFH 西安百川生物科技有限公司；LfcinB（氨基酸序列FKCRR WQWRM KKLGA PSITC VRRAF）、LfcinH（氨基酸序列GRRRR SVQWC AVSQP EATKC FQWQR NMRKV RGPPV SCIKR DSPIQ CIQA） 瀚海博興生物技術(shù)有限公司。

RPMI-1640完全培養(yǎng)基 美國(guó)HyClone公司；胎牛血清 德國(guó)BI公司；雙抗（青霉素和鏈霉素）、紅細(xì)胞裂解液、L-谷氨酰胺 Solarbio生物科技有限公司；磷酸脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、刀豆蛋白（concanavalin A，ConA） 美國(guó)Sigma公司；CCK-8試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HF90型CO2培養(yǎng)箱 北京市六一儀器廠；BPG-9070A鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；MHBS-1096A酶標(biāo)儀 南京DeTie公司；AE-31型倒置顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；DSX-280B高壓滅菌鍋 上海申安公司；血球計(jì)數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司；3K15高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；BSA224S分析天平、PB-10 pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備

將斷糧12 h的小鼠脫頸處死，在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液中浸泡15 min。將雙手及超凈無(wú)菌臺(tái)面用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液消毒，并用鑷子將小鼠轉(zhuǎn)移至解剖盤(pán)中。吸取10 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）注入干凈無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用解剖剪剪開(kāi)小鼠胸腔，取出脾臟置于PBS中，清除脂肪及筋膜組織，并用PBS淋洗1～2 次，放入盛有5 mL無(wú)菌PBS的離心管中，密封好帶入細(xì)胞培養(yǎng)室[24-25]。用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液擦拭雙手及超凈無(wú)菌臺(tái)面，吸取10 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，除去裝有脾臟的離心管中的PBS，將小鼠脾臟轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，用1 mL無(wú)菌注射器吸滿(mǎn)培養(yǎng)基，用針頭在不刺穿脾臟的前提下沖洗并擠壓小鼠脾臟，收集此時(shí)的脾細(xì)胞懸液到離心管中，用培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)皿1～2 次，同樣收集至離心管中，1 500 r/min離心5 min后，倒掉上清液，加入約4 倍體積的紅細(xì)胞裂解液并吹打細(xì)胞使其懸浮后靜置5 min后加入等量的PBS，1 500 r/min離心5 min以除去血紅細(xì)胞（若效果不夠理想可再次重復(fù)操作），再用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2 次[26-27]。將上述收集到的脾細(xì)胞置于裝有15 mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，至于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，除去其中所含的貼壁細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞數(shù)量待用。

1.3.2 LF及Lfcin對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響

將LFW、LFC、LFH用含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)基配制的質(zhì)量濃度為0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL的LF溶液，LfcinB與LfcinH用含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培養(yǎng)基配制的質(zhì)量濃度為50、75、100、125、150 μg/mL的Lfcin溶液，0.22 μL濾膜過(guò)濾備用。

將1.3.1節(jié)獲得的細(xì)胞濃度調(diào)至1×106個(gè)/mL，以每孔100 μL接種到96 孔培養(yǎng)板中。LF實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞懸液中加入LF溶液；Lfcin實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞懸液中加入Lfcin溶液；同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組：細(xì)胞懸液中加入等量的質(zhì)量濃度為5 μg/mL的ConA；陰性對(duì)照組：細(xì)胞懸液中只加入含10%的完全RPMI-1640培養(yǎng)基，添加量均為20 μL；空白組：每孔無(wú)細(xì)胞懸液，只含等量120 μL的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。每一質(zhì)量濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔避光加入10 μL CCK-8試劑[28-29]，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處振蕩60 s測(cè)定OD值，比較各組OD值來(lái)判斷處理細(xì)胞的最佳質(zhì)量濃度及最佳時(shí)間。根據(jù)下式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率[30]。

1.3.3 LF及Lfcin在ConA刺激下對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的影響

將1.3.1節(jié)獲得的細(xì)胞濃度調(diào)至1×106個(gè)/mL，然后接種到96 孔板中，每孔100 μL。LF＋ConA實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞懸液中加入LF溶液20 μL及5 μg/mL的ConA溶液20 μL；Lfcin＋ConA實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞懸液中加入配制的Lfcin溶液20 μL及5 μg/mL的Con A溶液20 μL；同時(shí)設(shè)對(duì)照組：細(xì)胞懸液中只加入等量含10%的完全RPMI-1640培養(yǎng)基及5 μg/mL ConA；空白組：每孔無(wú)細(xì)胞懸液、只含等量的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。每一質(zhì)量濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔避光加入10 μL CCK-8試劑，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處振蕩1 min測(cè)定OD值，比較各組OD值來(lái)判斷處理細(xì)胞的最佳質(zhì)量濃度。

1.3.4 LF及Lfcin在LPS刺激下對(duì)B 淋巴細(xì)胞增殖的影響

將上述1.3.1節(jié)獲得的細(xì)胞濃度調(diào)至1×106個(gè)/mL，以每孔100 μL接種到96 孔板中。LF＋LPS實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞懸液中加入配制的LF溶液20 μL及1 μg/mL的LPS溶液20 μL；Lfcin＋LPS實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞懸液中加入配制的Lfcin溶液20 μL及5 μg/mL的LPS溶液20 μL；同時(shí)設(shè)對(duì)照組：細(xì)胞懸液中只加入等量含10%的完全RPMI-1640培養(yǎng)基及1 μg/mL LPS；空白組：無(wú)細(xì)胞懸液、只含等量的140 μL完全培養(yǎng)基。每一質(zhì)量濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔避光加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處振蕩60 s測(cè)定OD值，比較各組OD值來(lái)判斷處理細(xì)胞的最佳質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差分析法比較差異顯著性，并用Sigma Plot 12.5軟件作圖，結(jié)果以 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 LF及Lfcin對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 LF對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞相對(duì)存活率的影響

表1 不同來(lái)源LF作用24 h后的淋巴細(xì)胞相對(duì)存活率Table1 Relative survival rates of lymphocytes after 24 h culture in the presence of LF from different sources%

由表1可知，在24 h時(shí)，4.00 mg/mL LFW及4.00 mg/mL LFH與陰性對(duì)照組相比顯著性差異（P＜0.05）。由表1中細(xì)胞相對(duì)存活率可知，LFW對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖效果相對(duì)高于其他兩種LF，其他兩種LF對(duì)細(xì)胞增殖既有促進(jìn)作用也有抑制作用，但促進(jìn)效果低于LFW的促進(jìn)效果。

表2 不同來(lái)源LF作用48 h后的淋巴細(xì)胞相對(duì)存活率Table2 Relative survival rates of lymphocytes after 48 h culture in the presence of LF from different sources%

由表2可以看出，在48 h時(shí)，1.00、2.00 mg/mL的LFC及1.00、2.00、4.00 mg/mL的LFH與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。由表2中細(xì)胞相對(duì)存活率可知，LF在48 h時(shí)作用效果隨質(zhì)量濃度增大呈先增強(qiáng)后下降的趨勢(shì)，LFW的作用效果隨時(shí)間及質(zhì)量濃度的變化波動(dòng)較小。

表3 不同來(lái)源LF作用72 h后的淋巴細(xì)胞相對(duì)存活率Table3 Relative survival rates of lymphocytes after 72 h culture in the presence LF from different sources%

由表3可以看出，在72 h時(shí)，0.50、1.00、4.00 mg/mL LFC及1.00、2.00、4.00 mg/mL LFH與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。由表3中細(xì)胞相對(duì)存活率可知，LF在72 h時(shí)3 種LF對(duì)細(xì)胞的增殖作用效果無(wú)明顯規(guī)律。

由表1～3可以看出，在不同時(shí)間內(nèi)不同來(lái)源的LF對(duì)淋巴細(xì)胞的作用程度不同，3 種LF在48 h的細(xì)胞相對(duì)存活率較高。表2顯示，LF在48 h時(shí)作用效果隨質(zhì)量濃度增大整體呈先增強(qiáng)后下降的趨勢(shì)，LFW的作用效果隨時(shí)間及質(zhì)量濃度的變化波動(dòng)較小。LFH在1.00 mg/mL時(shí)對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用效果最高，而LFC在2.00 mg/mL時(shí)效果與其最為接近。結(jié)果表明，LFH的最佳質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL，與細(xì)胞的添加比例為1∶5，LFC對(duì)細(xì)胞的增殖作用可替代LFH的作用效果，替代質(zhì)量濃度約為L(zhǎng)FH的2 倍。

2.1.2 Lfcin對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞相對(duì)存活率的影響

表4 不同來(lái)源Lfcin作用24、48、72 h后的小鼠脾淋巴細(xì)胞相對(duì)存活率Table4 Relative survival rates of lymphocytes after 24, 48 and 72 h in the presence of LF from different sources%

由表4可以看出，在24 h時(shí)，LfcinB及LfcinH與陰性對(duì)照組相比顯著性不差異（P＜0.05），但均在100 μg/mL時(shí)細(xì)胞相對(duì)存活率達(dá)到最大。在48 h時(shí)，75～150 μg/mL LfcinB及100 μg/mL LfcinH與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。LfcinH的最佳效果高于LfcinB的最佳效果。在72 h時(shí)，100 μg/mL LfcinH與對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。由細(xì)胞存活率可知，LfcinH的效果整體優(yōu)于LfcinB的作用效果。

不同時(shí)間內(nèi)LfcinB和LfcinH處理的淋巴細(xì)胞的存活率隨質(zhì)量濃度的升高均表現(xiàn)為先升高再降低的趨勢(shì)，并且48 h是促進(jìn)細(xì)胞增殖的最佳時(shí)間。表4中48 h的相對(duì)存活率顯示，LfcinB對(duì)淋巴細(xì)胞的促進(jìn)作用在125 μg/mL時(shí)達(dá)到最大，而LfcinH在100 μg/mL時(shí)達(dá)到最大，且效果優(yōu)于LfcinB的最大效果。結(jié)果表明，LfcinH的最佳添加質(zhì)量濃度為100 μg/mL，與細(xì)胞的添加比例為1∶5，LfcinB對(duì)細(xì)胞的增殖作用可替代LfcinH的作用效果，替代效果略差。

由表1～4可知，Lfcin與LF都在最大促進(jìn)作用效果時(shí)LFH的添加用量約為L(zhǎng)fcinH的10 倍，而LFB的添加量約為L(zhǎng)fcinB的16 倍，來(lái)源于牛乳與人乳的LF及Lfcin均可增強(qiáng)免疫淋巴細(xì)胞的存活率，且來(lái)源于人的LF及Lfcin對(duì)淋巴細(xì)胞存活的促進(jìn)效果高于來(lái)源于牛的LF及Lfcin，其中來(lái)源于牛乳的LFC作用效果大于LFW，并且使用Lfcin可大大降低使用劑量。

2.2 LF與Lfcin在ConA刺激下對(duì)T脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

圖1 LF與Con A共同作用48 h對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響Fig. 1 Effects of lactoferrin combined with ConA on the proliferation of spleen lymphocyte after 48 h culture

由圖1可以看出，LF與在ConA的刺激下培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，淋巴細(xì)胞的相對(duì)存活率均先升高后下降。LFW在0.10～4.00 mg/mL范圍內(nèi)對(duì)ConA刺激的淋巴細(xì)胞的增殖能力均為促進(jìn)作用，在0.50 mg/mL達(dá)到最大效果，但整體效果差異較小。LFC與LFH在0.10 mg/mL時(shí)抑制ConA刺激的淋巴細(xì)胞增殖，在0.25～4.00 mg/mL范圍內(nèi)促進(jìn)ConA刺激的淋巴細(xì)胞增殖，LFC在1.00 mg/mL時(shí)達(dá)到最大效果，LFH在0.50 mg/mL時(shí)達(dá)到最大效果，LFC高于其他兩種LF的最佳效果。結(jié)果表明，兩種LFB可在最大效果0.50 mg/mL處替代LFH的作用，且增加LFC的劑量可以達(dá)到更佳的效果。

圖2 Lfcin與ConA 共同作用48 h對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響Fig. 2 Effects of Lfcin combined with ConA on the proliferation of spleen lymphocyte after 48 h culture

由圖2可知，Lfcin在與ConA的刺激下培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，小鼠的免疫淋巴細(xì)胞的相對(duì)存活率均隨著Lfcin質(zhì)量濃度的增加而先升高后下降。LfcinB在75 μg/mL時(shí)作用效果達(dá)到最高，此質(zhì)量濃度LfcinH的作用效果與LfcinB的作用效果基本持平，而LfcinH在100 μg/mL時(shí)作用效果達(dá)到最高。結(jié)果表明，在與ConA共同按1∶1作用淋巴細(xì)胞時(shí)，LfcinB與LfcinH的最佳添加質(zhì)量濃度分別為75、100 μg/mL，按1∶5作用細(xì)胞懸液，但加大劑量會(huì)加強(qiáng)LfcinH的作用效果，LfcinB對(duì)細(xì)胞的增殖作用可替代LfcinH的作用效果，替代效果略差。

圖1、2結(jié)果顯示，Lfcin與LF都在最大促進(jìn)作用效果時(shí)LFH的添加用量約為L(zhǎng)fcinH的5 倍，而LFB的添加量約為L(zhǎng)fcinB的13 倍。LFH與ConA共同作用的最佳使用質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL，此作用效果可用同質(zhì)量濃度的LFW與LFC替代，且將LFC的劑量提高一倍所得效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于LFH的作用效果。由此表明，來(lái)源于牛乳的LF及Lfcin可替代來(lái)源于人乳的LF及Lfcin對(duì)免疫淋巴細(xì)胞存活率的影響作用，并且使用Lfcin可大大降低使用劑量。

2.3 LF與Lfcin在LPS刺激下對(duì)B脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

圖3 LF與 LPS 共同作用48 h對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響Fig. 3 Effects of lactoferrin combined with LPS on the proliferation of spleen lymphocyte after 48 h culture

由圖3可知，LF與LPS對(duì)免疫淋巴細(xì)胞協(xié)同刺激作用后，增強(qiáng)效果隨質(zhì)量濃度的提高先升高后降低，LFH在0.50～4.00 mg/mL范圍內(nèi)效果波動(dòng)不明顯，并在2.00 mg/mL時(shí)達(dá)到最大效果。LFW與LFC分別在0.50 mg/mL與2.00 mg/mL時(shí)可近似達(dá)到LFH的最大效果。結(jié)果表明，在與等量的LPS共同作用下，LFH的最佳添加質(zhì)量濃度為2.00 mg/mL，與細(xì)胞的添加比例為1∶5，LFW與LFC質(zhì)量濃度分別為0.50 mg/mL與2.00 mg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖作用可替代LFH的作用效果，替代效果略差。

圖4 Lfcin與LPS 共同作用48 h對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響Fig. 4 Effects of Lfcin combined with LPS on the proliferation of spleen lymphocyte after 48 h culture

由圖4可知，在分別與LPS按1∶1比例的共同作用下，50～100 μg/mL LfcinB與LfcinH對(duì)淋巴細(xì)胞均具有促進(jìn)增殖的作用，且均呈先升高后下降的趨勢(shì)。且LfcinH與LfcinB均在100 μg/mL時(shí)對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖促進(jìn)效果最佳。結(jié)果表明，LfcinB可替代LfcinH對(duì)免疫淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，但替代效果略差。

圖3、4結(jié)果顯示，在絲裂原LPS的作用下，Lfcin與LF都在最大促進(jìn)作用效果時(shí)LFH的添加用量約為L(zhǎng)fcinH的20 倍，而LFW的添加量約為L(zhǎng)fcinB的5 倍，LFC的添加量約為L(zhǎng)fcinB的20 倍，且來(lái)源于人乳的LF及Lfcin對(duì)淋巴細(xì)胞存活的促進(jìn)效果略高于來(lái)源于牛乳的LF及Lfcin，由此表明來(lái)源于牛乳的LF及Lfcin可替代來(lái)源于人乳的LF及Lfcin對(duì)免疫淋巴細(xì)胞存活率的影響作用，并且使用Lfcin可大大降低使用劑量。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以體外分離培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞作為細(xì)胞模型，對(duì)比LFW、LFC、LFH、LfcinB和LfcinH對(duì)其增殖作用的差異及相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)在相同用量的前提下，3 種LF及兩種Lfcin在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能有效地促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，同一質(zhì)量濃度的LF或Lfcin其促進(jìn)效果會(huì)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而有所改變。LFW、LFC、LFH與ConA、LPS對(duì)T、B淋巴細(xì)胞增殖刺激作用與質(zhì)量濃度有關(guān)，LfcinB、LfcinH與ConA、LPS對(duì)T、B淋巴細(xì)胞增殖有協(xié)同刺激作用，且隨著質(zhì)量濃度增加，協(xié)同作用增強(qiáng)。

根據(jù)LF單獨(dú)作用及在分裂刺激源ConA與LPS共同作用免疫淋巴細(xì)胞對(duì)其增殖作用顯示的最佳添加質(zhì)量濃度可知，在3 種不同作用條件下LFH在0.50～2.00 mg/mL范圍內(nèi)對(duì)免疫淋巴細(xì)胞的促進(jìn)效果最好，而LFW與LFC在此范圍內(nèi)可替代LFH的作用效果，且LFC效果更接近。LfcinH在3 種條件下在100 μg/mL時(shí)對(duì)免疫淋巴細(xì)胞的促進(jìn)效果最好，而LfcinB在75～125 μg/mL范圍內(nèi)效果相對(duì)最優(yōu)，在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)LfcinB可替代LfcinH的作用效果。3 種LF與兩種Lfcin的最大作用效果差距較小，說(shuō)明Lfcin是LF發(fā)揮免疫提高功效的主要部分。LFW與LFC在提高免疫方面能達(dá)到LFH的作用效果，進(jìn)一步說(shuō)明兩種LFB可替代LFH應(yīng)用于嬰兒配方產(chǎn)品中以提高嬰幼兒免疫能力，推薦添加質(zhì)量濃度為0.50～2.00 mg/mL，其中LFC的替代效果高于LFW的作用效果，此質(zhì)量濃度可充分發(fā)揮LF的免疫增強(qiáng)能力。并且Lfcin推薦添加質(zhì)量濃度為75～125 μg/mL，用相應(yīng)的Lfcin替代LF可大大降低用量。