張 燕，魏汝君，潘風(fēng)光，劉 珍，王寒松，劉靜波

（吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130062）

隨著經(jīng)濟發(fā)展，人們知識水平和生活水平不斷提高，人工合成抗氧化劑的安全性受到廣泛質(zhì)疑，因此引發(fā)人們對天然、安全來源的抗氧化劑研究的極大關(guān)注[1]。生物活性肽具有比氨基酸和蛋白質(zhì)更強的生物活性和多樣性，更易吸收并且安全可靠，已成為國內(nèi)外科技工作者的研究熱點和重點[2-5]。

長期以來，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)氧化劑與抗氧化劑之間失衡的狀態(tài)，當(dāng)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）積累過多，就會導(dǎo)致細(xì)胞及組織的氧化損傷。所有生物都有受到氧化應(yīng)激的可能性。在生物體內(nèi)少量自由基有積極的影響，但長期處于高含量自由基的環(huán)境中，可能導(dǎo)致機體重要的生物大分子遭到破壞，引發(fā)DNA突變，造成機體器官組織等的損傷并引發(fā)疾病。大量研究表明氧化應(yīng)激與多種慢性病和急性病有著密切的聯(lián)系，常見的有心血管疾病、癌癥、神經(jīng)紊亂、糖尿病、缺血再灌注和衰老[6-8]。研究報道ROS參與了一些人類退行性疾病的病因?qū)W，包括炎癥、心血管和神經(jīng)性的紊亂及癌癥。而生物活性肽以多種方式發(fā)揮其抗炎、抗氧化的特性，包括清除自由基、抑制ROS的產(chǎn)生以及抑制促炎細(xì)胞因子的釋放等[9-13]。

禽蛋蛋白質(zhì)含量豐富，且其氨基酸組成與人類必需氨基酸比例接近，是獲取生物活性肽的良好資源。因此，本實驗從細(xì)胞水平考察了蛋清源抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制作用及抗炎效應(yīng)，為預(yù)防氧化應(yīng)激可能對人體造成的傷害提供新的思路，為雞蛋在食品深加工、制藥和化妝品等應(yīng)用中提供理論依據(jù)，并有助于人們深入了解機體氧化應(yīng)激狀態(tài)的機制和根本原因，進一步為增加蛋品多方面利用價值和提高蛋品利潤創(chuàng)造空間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋清源肽（＞95%） 上海強耀生物科技有限公司；Trolox（分析純）、2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 美國Sigma公司；人胚腎細(xì)胞（HEK293） 中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基美國Gibco公司；H2O2（分析純） 天津化學(xué)有限公司；MTS單細(xì)胞溶液增殖檢測試劑盒 美國Promega公司；還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、氧化型谷胱甘肽（oxidized GSH，GSSH）檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒 武漢伊艾博科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；多功能酶標(biāo)儀美國伯騰儀器有限公司；黑色孔板（透明平底） 德國Greiner Bio-One公司；移液器 德國Eppendorf公司；超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱 上海力申科學(xué)儀器有限公司；低速離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；倒置生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋清源活性肽對ABTS＋?清除活性測定

ABTS與過氧化物酶和氫過氧化物在一起形成ABTS＋?。在抗氧化劑存在時，這種自由基混合物的吸光度下降，下降程度取決于抗氧化劑的抗氧化能力。ABTS＋?清除活性按照實驗室已建立的方法[14]進行測定，并略有修改。取10 mg ABTS于蒸餾水中配制成7 mmol/L的ABTS溶液，與過硫酸鉀溶液（終濃度為2.45 mmol/L）按1∶1的體積比混合即得ABTS儲備液，使用前需在室溫條件下避光放置12～16 h。測定前用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋ABTS儲備液至吸光度為0.70±0.02，即為ABTS工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。實驗分為3 組，每個樣品濃度3 個復(fù)孔?？瞻捉M：每孔加200 μL PBS；對照組：每孔180 μL ABTS工作液、20 μL PBS；實驗組：每孔180 μL ABTS工作液、20 μL肽溶液（終濃度分別為1、5、10、15、20、25、30、35、40 μmol/L）。以Trolox溶液作為標(biāo)準(zhǔn)參照物，設(shè)置系列濃度梯度的Trolox溶液（10、20、50、100 μmol/L）與ABTS工作液反應(yīng)，以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，ABTS＋?清除率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Trolox抗氧化當(dāng)量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC），即被測抗氧化劑清除ABTS＋?的能力（吸光度大小的變化）與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑Trolox清除ABTS＋?能力的比值。從而確定各條肽的相對抗氧化活性。ABTS＋?清除率根據(jù)下式計算。

式中：A1、A2、A3分別為實驗組、對照組、空白組的吸光度。

1.3.2 蛋清源抗氧化肽對HEK293 細(xì)胞氧化損傷的保護作用

1.3.2.1 HEK293細(xì)胞氧化損傷模型的建立

接種密度為5.0×104cells/mL的HEK293細(xì)胞于96 孔板中。分別設(shè)置空白組、對照組和實驗組，空白組每孔加100 μL培養(yǎng)基；對照組加90 μL細(xì)胞混懸液和10 μL培養(yǎng)基；實驗組各孔加90 μL細(xì)胞混懸液。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，實驗組分別加入10 μL終濃度為200、300、400、500、600、700、800、900 μmol/L的H2O2（每個濃度設(shè)置6 個復(fù)孔），繼續(xù)孵育24 h后，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS）法[15]測定細(xì)胞存活率，當(dāng)細(xì)胞存活率為50%時，對應(yīng)的H2O2濃度即為建立HEK293細(xì)胞氧化損傷模型的最佳損傷濃度。

1.3.2.2 蛋清源活性肽對H2O2氧化損傷的HEK293細(xì)胞的保護作用

將密度為6.0×104cells/mL的HEK293細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔接種80 μL。分別設(shè)置空白組、對照組、損傷組和保護組，空白組加100 μL培養(yǎng)基；對照組加入80 μL細(xì)胞混懸液和20 μL培養(yǎng)基；損傷組和保護組都加80 μL細(xì)胞混懸液，每個實驗濃度設(shè)置6 個復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，保護組加入10 μL終濃度1、10、20 、30、40、50、60 μmol/L的蛋清肽溶液，即WNWAD（Trp-Asn-Trp-Ala-Asp）、WNW（Trp-Asn-Trp）、WAD（Trp-Ala-Asp）、WN（Trp-Asn）、AD（Ala-Asp），同時損傷組加入10 μL培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h后損傷組和保護組同時加入10 μL終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液，繼續(xù)孵育12 h后，MTS法測定細(xì)胞存活率。

1.3.3 GSSG含量與GSH/GSSG比值的測定

將HEK293細(xì)胞接種于6 孔中，細(xì)胞密度為5.0×105cells/mL，每孔接種量為1.5 mL。分別設(shè)置空白組、對照組、損傷組和保護組，空白組加1.5 mL培養(yǎng)基；對照組加入1.0 mL細(xì)胞混懸液和500 μL培養(yǎng)基；損傷組和保護組各加1.0 mL細(xì)胞混懸液，每個實驗濃度設(shè)置6 個復(fù)孔。5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后保護組加入250 μL終濃度為1、5、10 μmol/L的蛋清源活性肽WNWAD溶液，損傷組加250 μL培養(yǎng)基。5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后損傷組和保護組同時加入250 μL終濃度為400 μmol/L的H2O2溶液。繼續(xù)孵育12 h后按照GSH和GSSG檢測試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 IL-8與TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定分析

細(xì)胞分組及培養(yǎng)同1.3.3節(jié)，繼續(xù)孵育12 h后按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋清源活性肽WNWAD、WNW、WAD、WN、AD對ABTS＋·清除活性的影響

ABTS＋·清除法被各研究機構(gòu)廣泛應(yīng)用于食品和天然水溶性酚類物質(zhì)抗氧化活性的測定[16]。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)參照，得ABTS＋·清除率標(biāo)準(zhǔn)曲線（未給出）及擬合方程為y＝0.952 4x＋4.342 9，R2＝0.990 1，兩者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。由圖1可知，蛋清源肽WNWAD、WNW、WAD、WN隨著濃度的增加，其清除ABTS＋·能力也逐漸遞增，而肽AD無ABTS＋·清除能力。在濃度為40 μmol/L時，WNWAD清除ABTS＋·能力最強，TEAC為（98.411±0.020）μmol TE/L，其次為WN、WNW、WAD，其TEAC分別為（96.629±0.008）、（94.978±0.003）和（88.807±0.003）μmol TE/L。Hernández-Ledesma等[17]將發(fā)酵乳中水溶性部分通過反相高效液相色譜進行分離得到抗氧化肽，研究其抗氧化活性和降壓活性，得到His、Pro（疏水性氨基酸）對抗氧化的影響最大；Trp（疏水性氨基酸）、Tyr對ABTS＋·清除的貢獻(xiàn)最大，因為這類氨基酸的吲哚基和苯環(huán)可供氫。研究發(fā)現(xiàn)含疏水性氨基酸（如Ala、Val、Leu）的抗氧化肽活性與這些分子中特定的疏水性氨基酸殘基與脂或脂肪酸的親和性相關(guān)。而ABTS＋·清除能力較強的4 條肽都含有Trp，其中的N—H鍵易發(fā)生均裂，產(chǎn)生氫自由基（H?），即是氫供體。

圖1 蛋清源活性肽清除ABTS＋·能力Fig. 1 Trolox equivalent antioxidant capacity of peptides from egg white proteins

2.2 HEK293細(xì)胞氧化損傷模型的建立

圖2 不同濃度H2O2對HEK293細(xì)胞相對存活率的影響Fig. 2 HEK293 cells relative viability under H2O2 treatment

H2O2是一種活性氧，可引發(fā)脂質(zhì)過氧化從而增強氧化應(yīng)激，最終可導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡[18]。由圖2可知，隨H2O2濃度升高，細(xì)胞存活率逐漸降低，即氧化損傷作用逐漸加強。H2O2終濃度為400 μmol/L時HEK293細(xì)胞相對存活率為（50.240±0.505）%，與對照組相比有高度顯著性差異（P＜0.001），而H2O2終濃度為900 μmol/L時細(xì)胞存活率僅為（10.404±0.831）%，由于氧化應(yīng)激過于嚴(yán)重導(dǎo)致存活率極低。綜合考慮，以400 μmol/L的H2O2濃度作為誘導(dǎo)損傷模型的最佳濃度。

2.3 蛋清源活性肽對H2O2誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞氧化損傷的影響

2.3.1 不同濃度WNWAD、WNW、WAD、WN對氧化損傷細(xì)胞的影響

蛋清源活性肽WNWAD、WNW、WAD和WN對H2O2誘導(dǎo)氧化損傷的HEK293細(xì)胞具有保護作用（圖3）。結(jié)果表明，H2O2處理的損傷組細(xì)胞相對存活率為（49.8±2.0）%，用不同濃度的肽處理氧化損傷的HEK293細(xì)胞后，細(xì)胞相對存活率均有所提高。濃度為1 μmol/L的WNWAD、WNW、WAD、WN處理細(xì)胞后相對存活率分別提高至（96.120±0.059）%、（63.300±0.019）%、（59.580±0.047）%、（74.550±0.024）%。隨著肽濃度的升高，細(xì)胞相對存活率隨之提高，WNWAD活性最強。蛋清肽WNWAD在濃度為40 μmol/L時，細(xì)胞相對存活率已經(jīng)恢復(fù)到100%。芳香族氨基酸Trp、Tyr可通過供氫發(fā)揮抗氧化作用[17]，Saito等[20]發(fā)現(xiàn)在C端含有Trp和Tyr的三肽具有很強的自由基清除能力。而本實驗中活性肽WNWAD、WN、WNW、WAD具有抗氧化能力可能也是N端的氨基酸Trp發(fā)揮的自由基清除能力。

圖3 蛋清源肽對H2O2誘導(dǎo)損傷HEK293細(xì)胞的保護作用Fig. 3 Protective effect of peptides from egg white proteins on H2O2-induced oxidative damage in HEK293 cells

2.3.2 較低濃度WNWAD對氧化損傷細(xì)胞的影響

圖 4 WNWAD對H2O2氧化損傷的HEK293細(xì)胞的保護作用Fig. 4 Protective effect of WNWAD on H2O2-induced oxidative damage in HEK293 cells

從2.3.1節(jié)實驗結(jié)果可看出，WNWAD的抗氧化性較其他4 條肽強，在較低濃度時細(xì)胞相對存活率已經(jīng)達(dá)到95%以上。濃度為1.0 μmol/L的WNWAD處理H2O2氧化損傷的細(xì)胞后，細(xì)胞相對存活率達(dá)到（96.120±0.059）%，其氧化應(yīng)激抑制作用極強。因此考察了較低濃度的WNWAD對氧化損傷細(xì)胞的保護作用。隨著活性肽濃度的增大，細(xì)胞存活率有一定幅度的增加但增速不明顯（圖4），綜合考慮選用1.0 μmol/L的WNWAD進行后續(xù)實驗。

2.4 WNWAD對細(xì)胞內(nèi)GSSG濃度的影響

袁平戈等[21]研究表明GSH是細(xì)胞內(nèi)的天然抗氧化劑，主要完成氧自由基的清除，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下其自身被氧化成GSSG。有文獻(xiàn)報道長時間力竭運動促使肝臟活性氧產(chǎn)生增加，導(dǎo)致GSH氧化為GSSG，GSH含量減少，GSSG含量增加，雖然當(dāng)GSSG累積時，肝臟可將GSSG排入膽管，但最終GSH/GSSG的比值仍下降[22]。H2O2刺激細(xì)胞產(chǎn)生活性氧從而引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激，抗氧化成分的存在可有效消除H2O2刺激機體產(chǎn)生的氧自由基，降低GSSG含量，保持GSH/GSSG比值的穩(wěn)定[22-23]。

圖 5 WNWAD對HEK293細(xì)胞內(nèi)GSSG濃度的影響Fig. 5 Effect of WNWAD on the content of GSSG in HEK293 cells

如圖5所示，對照組的細(xì)胞中GSSG濃度為0.90 μmol/L，而損傷組則顯著升高為33.23 μmol/L，不同濃度的WNWAD處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)GSSG濃度明顯降低，其中0.5 μmol/L的WNWAD作用下GSSG濃度為0.96 μmol/L，接近于對照組細(xì)胞內(nèi)GSSG濃度。但是，WNWAD濃度從0.5 μmol/L上升至10 μmol/L時，GSSG濃度有小幅提高，此現(xiàn)象出現(xiàn)原因需要進一步的實驗研究。可見低濃度的WNWAD可以較大程度地減少細(xì)胞內(nèi)GSSG的產(chǎn)生，其氧化應(yīng)激抑制作用較強。GSSG濃度過高或GSH/GSSG比值不穩(wěn)定可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)型錯誤，從而影響細(xì)胞的正常生理代謝，WNWAD可以一定程度通過降低體內(nèi)GSSG濃度的升高，維持GSH/GSSG比值的穩(wěn)定與平衡來減小蛋白質(zhì)折疊錯誤的機率而保護機體。

2.5 WNWAD對細(xì)胞內(nèi)IL-8質(zhì)量濃度的影響

IL-8是由Yoshimura等[24]首先發(fā)現(xiàn)的具有趨化功能的細(xì)胞因子。由于IL-8對于白細(xì)胞有趨化作用，所以在很多感染性疾病過程中其含量就會升高，IL-8水平與心血管疾病、肝臟疾病、呼吸道疾病等疾病有關(guān)，人外周血、尿液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8水平可作為炎性疾病的臨床指標(biāo)[25]。IL-8是生物作用非常強的炎癥因子，如吸引白細(xì)胞到炎癥局部、活化淋巴細(xì)胞、刺激其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生及促進角朊細(xì)胞增殖等[26]。

如圖6所示，對照組細(xì)胞中IL-8質(zhì)量濃度為0.16 μg/L，經(jīng)過H2O2處理過的HEK293細(xì)胞其上清液中IL-8質(zhì)量濃度顯著升高，加入WNWAD后，細(xì)胞中IL-8質(zhì)量濃度又恢復(fù)到正常水平，與損傷組相比，WNWAD可顯著降低細(xì)胞中的IL-8質(zhì)量濃度。有研究表明IL-8與人體內(nèi)白細(xì)胞的下降是同步的[27]。IL-8在惡性腫瘤中表達(dá)量高，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也關(guān)系密切，所以，WNWAD對于IL-8的表達(dá)有一定的抑制作用，進而可能抑制炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為緩解病情提供幫助。

圖 6 WNWAD對細(xì)胞內(nèi)IL-8質(zhì)量濃度的影響Fig. 6 Effect of WNWAD on IL-8 level in HEK293 cells

2.6 WNWAD對細(xì)胞內(nèi)TNF-α質(zhì)量濃度的影響

TNF-α與炎癥反應(yīng)有關(guān)，而炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激又有密切的關(guān)系，TNF-α可直接誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，造成細(xì)胞氧化損傷的進一步加重，促使細(xì)胞壞死凋亡[28-29]。炎癥疾病中，TNF-α主要來源于單核巨噬細(xì)胞，同時淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞等也能產(chǎn)生和釋放TNF-α[30]。

圖 7 WNWAD對細(xì)胞內(nèi)TNF-α質(zhì)量濃度的影響Fig. 7 Effect of WNWAD on TNF-α level in HEK293 cells

由圖7可知，H2O2誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞中TNF-α質(zhì)量濃度大幅增加，達(dá)到0.406 μg/L，1 μmol/L WNWAD保護的細(xì)胞可有效地降低TNF-α的質(zhì)量濃度，TNF-α表達(dá)水平變化可最先反映胰腺受損，TNF-α質(zhì)量濃度的上升又促進IL-8質(zhì)量濃度的升高，IL-8質(zhì)量濃度與胰腺功能受損的情況成正比[31]，WNWAD可抑制TNF-α因子的釋放，減弱炎癥反應(yīng)，可能減少胰腺的損傷。

3 結(jié) 論

氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡而導(dǎo)致產(chǎn)生了大量的中間氧化產(chǎn)物，即產(chǎn)生了過多的自由基。在對蛋清源肽WNWAD、WNW、WAD、WN、AD的氧化應(yīng)激抑制作用研究中，發(fā)現(xiàn)除了肽AD外，WNWAD、WNW、WAD、WN 4 條肽在體外化學(xué)水平及細(xì)胞水平均表現(xiàn)出優(yōu)良的抗氧化活性，其中WNWAD氧化應(yīng)激抑制作用最強，在較低濃度時（1 μmol/L），WNWAD對H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷細(xì)胞表現(xiàn)出很強的保護作用。并且WNWAD可明顯降低細(xì)胞中GSSG濃度，維持GSH/GSSG比值的平衡與穩(wěn)定，可有效抑制IL-8和TNF-α的釋放。以上研究結(jié)果顯示蛋清源活性肽對降低HEK293細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和提高細(xì)胞抗氧化能力、抗炎能力等有重要作用，其具體的抑制機理有待進一步探究。