張雪瑩，郭超凡，陶 飛，王云陽，傅虹飛

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

玉米醇溶蛋白是玉米的主要貯藏蛋白，主要通過溶劑萃取法從玉米麩粉中獲得[1]。玉米醇溶蛋白具有環(huán)保、無毒、可生物降解和乳化性、持水性、延展性良好等優(yōu)點，是一種有廣泛應(yīng)用前景的食品材料。由于氨基酸組成不平衡，玉米醇溶蛋白形成了獨特的溶解性、分子形態(tài)和分子結(jié)構(gòu)，使其具有良好的成膜性，所成膜透明、均勻、有韌性[2]。作為兩親蛋白質(zhì)，玉米醇溶蛋白還可形成膠體納米粒子，使其成為食品和生物工業(yè)中藥物和微量營養(yǎng)素的理想輸送載體[3]。

通過了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性之間的關(guān)系以預測蛋白質(zhì)在食品加工中的適用性，從而通過適當?shù)母男苑椒ㄐ揎椀鞍滓詳U大其應(yīng)用范圍是非常重要的。有學者報道了脫酰胺[4]、磷酸化[5]、酶催化[6]以及擠壓膨化法[7]修飾玉米醇溶蛋白的功能特性。熱處理作為最受歡迎的修改蛋白質(zhì)功能的物理改性方法之一，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于改變水溶性蛋白質(zhì)如花生蛋白[8]、乳清蛋白[9]、乳鐵蛋白[10]和大豆分離蛋白[11]的物理化學性質(zhì)。然而關(guān)于醇溶蛋白的熱處理和物理化學變化的報道較為少見。Selling等[12]通過圓二色譜研究了溫度（25～70 ℃）對玉米醇溶蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)在70 ℃熱處理15 min引起了玉米醇溶蛋白初級結(jié)構(gòu)的改變。Sun Cuixia等[13]采用不同熱處理溫度（75、85、95 ℃）和時間（15、30、45 min）處理玉米醇溶蛋白，發(fā)現(xiàn)不同溫度和時間對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、形態(tài)有不同的影響。

與傳統(tǒng)處理方法相比，新的食品加工技術(shù)（如微波（microwave，MW）和射頻（radio frequency，RF）技術(shù)）具有低能耗、產(chǎn)品品質(zhì)高等優(yōu)點，有望運用在蛋白質(zhì)的熱改性研究中。微波是指頻率為300 MHz～300 GHz的電磁波，能夠引起物料分子振動，從而在分子級對物料產(chǎn)生影響。微波使食品物料中的極性分子在高頻電場作用下發(fā)生相互摩擦和碰撞，將微波場能轉(zhuǎn)化為熱能，使物料溫度升高[14]。射頻的加熱原理類似于微波，但頻率范圍從1 MHz到300 MHz。Guan Junjun等[15]使用實驗室規(guī)模的微波爐加熱大豆分離蛋白，結(jié)果表明，微波處理30 min破壞了蛋白質(zhì)分子的二硫鍵，增加了巰基和表面疏水基團的數(shù)量，促進了蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，形成了具有均勻緊湊網(wǎng)絡(luò)的凝膠。張海華等[16]分別使用600、800、1 000 W微波功率處理小麥面筋蛋白，并采用傅里葉變換紅外光譜對小麥面筋蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)微波處理后面筋蛋白的二級結(jié)構(gòu)隨微波功率不同而發(fā)生不同變化，微波處理后面筋蛋白的表面疏水性以及巰基含量升高。Guo Chaofan等[17]使用27.12 MHz頻率的射頻在不同終點溫度（70、80、90 ℃）和電極間隙（120、160、200 mm）下對大豆分離蛋白進行處理，發(fā)現(xiàn)射頻加熱引起蛋白巰基、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的明顯變化。然而目前鮮見關(guān)于微波、射頻對玉米醇溶蛋白處理的報道。

本研究的目的是探討水?。╳ater bath，WB）加熱、微波加熱、射頻加熱3 種處理方式對玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)特性、功能特性的影響，為蛋白質(zhì)改性提供基礎(chǔ)研究，找出更有效的熱改性方法以增加玉米醇溶蛋白的附加值，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白粉 西格瑪奧德里奇公司；福林-酚試劑 上海荔達生物科技有限公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SJ-9A-27-JY射頻加熱器 河北華氏紀元高頻設(shè)備有限公司；EMA34GTQ-SS微波爐 廣東美的微波爐制造有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計日本島津有限公司；Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀德國布魯克光譜儀器公司；Q200差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 美國TA儀器公司；HQ-FTS-DIF00熒光光纖測溫儀 西安和其光電科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將0.8 g玉米醇溶蛋白溶解在80 mL蒸餾水中制備玉米醇溶蛋白分散液（10 mg/mL），密封振蕩至完全水合。

1.3.2 樣品升溫曲線的測定

使用水浴、射頻和微波3 種處理方式對玉米醇溶蛋白分散液進行加熱，溶液中心溫度分別達70、80、90 ℃時停止加熱。將裝有80 mL玉米醇溶蛋白分散液的100 mL離心管放入相應(yīng)目標溫度的水浴鍋中進行水浴加熱，將熱電偶插入分散液中心位置；微波處理時設(shè)置微波強度為中火，將離心管放置在微波爐中心位置，使用熱電偶測溫；將離心管放入極板間距為120 mm、頻率為27.12 MHz的射頻底部電極板中心進行射頻加熱，并插入測溫光纖探頭至分散液中心位置。記錄時間-溫度曲線。

1.3.3 玉米醇溶蛋白溶解度測定

將熱處理前后的玉米醇溶蛋白溶液在轉(zhuǎn)速10 000 r/min下離心10 min，用福林-酚法測定上清液中蛋白質(zhì)量濃度[18]，取牛血清白蛋白作為標準品，繪制標準曲線，根據(jù)上清液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度來計算溶解度。

1.3.4 玉米醇溶蛋白乳化性能測定

玉米醇溶蛋白的乳化性能包括乳化能力（emulsifying capacity，EC）和乳化穩(wěn)定性（emulsifying stability，ES）。參照Li Yuanyuan等[19]的方法并進行改進。

取玉米醇溶蛋白分散液24 mL，加入8 mL大豆油，使用高速分散均質(zhì)機（10 000 r/min）分散2 min，迅速用微量注射器從均質(zhì)后的樣品底部吸取50 μL乳化液并移入5 mL 0.1%（質(zhì)量分數(shù)，下同）的十二烷基硫酸鈉溶液中，以十二烷基硫酸鈉（0.1%）溶液為對照，測定500 nm波長處的吸光度。乳化能力以吸光度×100表示。

將測定乳化能力后的乳液在室溫下放置30 min，按照上述方法再次測定乳化能力。按照公式（1）計算乳化穩(wěn)定性。

式中：EC為乳化能力；EC30為30 min后的乳化能力。

1.3.5 玉米醇溶蛋白巰基含量測定

采用Beveridge[20]和Cabra[21]等的方法針對玉米醇溶蛋白進行了改進：將不同熱處理后的蛋白樣品經(jīng)冷凍干燥后，用體積分數(shù)70%的乙醇溶液配成2.0 mg/mL的玉米蛋白乙醇溶液，取1 mL玉米蛋白乙醇溶液，加入5 mL含9 mol/L尿素的0.1%乙二胺四乙酸溶液（現(xiàn)配），再加入0.05 mL的4 mg/mL的5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）溶液添加顏色反應(yīng)，迅速混勻后在35 ℃下反應(yīng)30 min，在412 nm波長處比色，以1 mL 70%的乙醇溶液作為空白對照。按照公式（2）計算巰基含量。

式中：cSH為巰基含量/（μmol/g）；A412nm為412 nm波長處吸光度；ρS為樣品質(zhì)量濃度/（mg/mL）；D為稀釋因子，對于計算巰基含量為6.05。

1.3.6 玉米醇溶蛋白變性溫度的測定

本實驗使用DSC法測定熱處理前后的玉米醇溶蛋白變性溫度。將樣品冷凍干燥，稱取樣品2～3 mg于鋁坩鍋中，氮氣流速20 mL/min，升溫速率為10 ℃/min；掃描范圍為20～150 ℃，得到DSC曲線。使用TA Universal Analysis 2000軟件分析。

1.3.7 玉米醇溶蛋白紫外光譜掃描

將不同熱處理后的蛋白樣品經(jīng)冷凍干燥處理后，用體積分數(shù)70%的乙醇溶液溶解至1 mg/mL進行紫外光譜掃描，掃描波長為245～445 nm，掃描速率為0.1 nm/s。

1.3.8 玉米醇溶蛋白傅里葉變換紅外光譜測定

使用Tensor 27傅里葉變換紅外光譜儀，KBr與1 mg凍干樣品研磨，壓片。掃描范圍4 000～400 cm－1，掃描264 次，分辨率4 cm－1。在相同條件下收集不同樣品的光譜。二級結(jié)構(gòu)使用Peak Fit V4.12軟件進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用3 次重復實驗結(jié)果計算平均值和標準差。數(shù)據(jù)在95%的置信度水平下，用SPSS軟件進行Tukey檢驗，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米醇溶蛋白分散液的不同熱處理升溫曲線

由圖1可見，3 種加熱方式中微波加熱升溫迅速，升溫至90 ℃總用時約60 s，基本呈線性上升狀態(tài)，無明顯變快或變緩的趨勢。水浴次之，升溫至90 ℃總用時約為650 s，這是由于水浴加熱主要靠熱傳導提高溫度，而試管的導熱性較差。水浴升溫速度呈先快后慢趨勢，原因為熱傳導過程中溫差越大升溫越快。射頻加熱升溫速度較慢，升溫至90 ℃大致用時900 s，整體趨勢是先慢后快，但變化幅度較為平緩，可能的原因為射頻加熱主要是利用水中極性物質(zhì)在電場中的振蕩來實現(xiàn)溫度的上升，由于蒸餾水中極性物質(zhì)含量較少，因此升溫較慢。當溫度升高后，蛋白質(zhì)溶解度提高，水中極性物質(zhì)含量升高，加熱速度變快。

圖1 不同熱處理方式下的玉米醇溶蛋白分散液的升溫曲線Fig. 1 Temperature-time curve of zein dispersion under different heat treatments

2.2 熱處理對玉米醇溶蛋白溶解度的影響

圖2 不同熱處理對玉米醇溶蛋白分散液溶解度的影響Fig. 2 Effects of different heat treatments on the solubility of zein dispersion

由圖2可以看出，射頻處理對于玉米醇溶蛋白溶解度影響最大，微波次之，水浴影響最小，且溶解度皆隨處理溫度的提高而增大。比較發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)處理的樣品相比，經(jīng)熱處理后的玉米醇溶蛋白的溶解性發(fā)生了顯著提高（P＜0.05）。蛋白分散液在水浴加熱至70 ℃時溶解度為181 μg/mL，比對照組提高了27.46%，這是在該系列熱處理中變化程度最小的處理條件。其他不同熱處理方式和終點溫度下溶解度變化均超過40.00%，如溶解度變化最大的處理條件——射頻處理至90 ℃，蛋白溶解度達248 μg/mL，相比對照組提高了74.65%。對于各種熱處理方式而言，玉米醇溶蛋白在達到相同終點溫度時，射頻、微波處理比水浴處理的溶解度有顯著提高（P＜0.05）。在90 ℃時，射頻處理的醇溶蛋白溶解度比水浴處理提高了20.30%。微波和射頻的高頻電場不但會引起物料內(nèi)部極性分子摩擦生熱，還可因摩擦使分子間共價鍵或非共價鍵發(fā)生斷裂[22]，使玉米醇溶蛋白結(jié)構(gòu)展開，與水的相互作用增強，從而使溶解度提高。

2.3 熱處理對玉米醇溶蛋白乳化性能的影響

圖3 不同熱處理對玉米醇溶蛋白分散液乳化能力的影響Fig. 3 Effects of different heated treatments on emulsifying capacity of zein dispersion

每克蛋白質(zhì)的乳狀液在從O/W型乳狀液轉(zhuǎn)變成W/O型乳狀液前所能乳化油的體積為蛋白質(zhì)的乳化能力，而乳狀液的穩(wěn)定程度為乳化穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)的乳化性能與其溶解性有一定關(guān)系[23]。如圖3所示，經(jīng)熱處理后的玉米醇溶蛋白乳化能力顯著提高（P＜0.05），并隨溫度升高而增大，這可能是由于隨著溫度升高，玉米醇溶蛋白在溶液中的溶解度提高，使得O/W界面處的蛋白吸附增強，從而防止液滴聚集或沉淀[19]。當熱處理終點溫度為80 ℃時，玉米醇溶蛋白的乳化能力在3 種處理方式下均沒有顯著性差異，處理至70 ℃和90 ℃時，微波和射頻處理的玉米醇溶蛋白乳化能力顯著高于水浴處理。經(jīng)射頻處理至90 ℃的蛋白乳化能力比對照組提高了171.7%。

圖4 不同熱處理對玉米醇溶蛋白分散液乳化穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Effects of different heat treatments on the emulsifying stability of zein dispersion

由圖4可以看出，除微波處理至70 ℃的玉米醇溶蛋白，經(jīng)其他處理后的蛋白乳化穩(wěn)定性顯著降低。乳化穩(wěn)定性整體隨著溫度的升高而降低。熱處理使玉米醇溶蛋白分子極化并展開，在蛋白質(zhì)表面暴露出內(nèi)部的疏水殘基，促進生成O/W界面，這也是玉米醇溶蛋白乳化能力升高的原因[24]。而隨著暴露出的疏水殘基增多，新的非共價鍵在玉米醇溶蛋白分子之間形成，使玉米醇溶蛋白分子形成更大的分子聚集體，從而降低了O/W界面的穩(wěn)定性，使蛋白的乳化能力下降。

2.4 熱處理對玉米醇溶蛋白分散液巰基含量的影響

巰基含量是蛋白質(zhì)改性研究的一個重要指標[25]。從圖5可以發(fā)現(xiàn)，與對照組樣品相比，除70 ℃微波和水浴處理蛋白外，其他不同熱處理方式和溫度均使得玉米醇溶蛋白的巰基含量發(fā)生了顯著變化（P＜0.05），射頻處理至90 ℃蛋白巰基含量增加最多，為20.315 μmol/g，相對未處理樣品提高了約53.94%。說明蛋白分子中的部分亞基解離，二硫鍵斷裂生成巰基，或熱處理使蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)展開導致內(nèi)部巰基暴露[26]。這與Guo Chaofan等[17]使用不同極板間距的射頻處理大豆分離蛋白均使蛋白巰基含量顯著提高的結(jié)果一致。對于各種熱處理方式而言，玉米醇溶蛋白的巰基含量均隨處理溫度的升高而增大。其中，除70 ℃外，對于相同溫度，射頻和微波處理的巰基含量均顯著高于水浴處理。加熱至90 ℃時，射頻處理的玉米醇溶蛋白巰基含量比水浴處理高19.13%，而加熱至80 ℃時，微波處理比水浴處理高17.87%。這可能是由于射頻和微波處理使蛋白分子中的偶極子隨快速變換的電磁場快速轉(zhuǎn)變，不但可互相摩擦產(chǎn)生熱量，還會引起微觀分子空間結(jié)構(gòu)上的變化[17]。微波相較于射頻處理對玉米醇溶蛋白效果不明顯，可能是由于達到相同溫度微波作用時間較射頻處理短。

圖5 不同熱處理對玉米醇溶蛋白巰基含量的影響Fig. 5 Effects of different heat treatments on free sulfhydryl content of zein

2.5 熱處理對玉米醇溶蛋白變性溫度的影響

圖6 不同熱處理條件加熱玉米醇溶蛋白分散液的DSC圖譜Fig. 6 DSC thermograms of zein dispersion under different heat treatment conditions

DSC法廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)熱變性的研究[27]。在DSC圖譜中，最大峰對應(yīng)的溫度通常被用來確定蛋白質(zhì)變性溫度，同時，變性溫度代表了蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性及聚集程度。由圖6

可以看出，微波處理的玉米醇溶蛋白變性溫度略有上升，說明微波處理可提高玉米醇溶蛋白的熱穩(wěn)定性。經(jīng)水浴和射頻處理的玉米醇溶蛋白變性溫度相對于未處理的樣品有所降低，這可能歸因于水浴和射頻過長的熱處理時間破壞了有利于玉米蛋白形成穩(wěn)定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的維持蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的化學鍵及相互作用力[28]，導致玉米醇溶蛋白的部分展開，因此熱穩(wěn)定性降低。水浴處理玉米醇溶蛋白至70、80、90 ℃時變性溫度逐漸降低，而射頻處理玉米醇溶蛋白至與水浴同樣的終點溫度變性溫度逐漸升高，說明變性溫度的變化不僅與加熱終點溫度有關(guān)，還與加熱方式有關(guān)。

2.6 熱處理后玉米醇溶蛋白紫外光譜分析

圖7 不同熱處理條件加熱玉米醇溶蛋白分散液的紫外吸收光譜Fig. 7 Ultraviolet absorption spectra of zein dispersion under different heat treatment conditions

紫外光譜掃描可以直接反應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及化學變化。由圖7觀察到，玉米醇溶蛋白溶液在278 nm波長處表現(xiàn)出明顯的紫外吸收，這歸因于吸收峰波長分別為285 nm和277 nm的色氨酸和酪氨酸殘基的振動。由圖7a可知，在水浴加熱條件下，峰強度相對于對照組有所下降，原因可能是蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生聚集，發(fā)色基團被包裹，紫外光吸收基團減少。微波加熱（圖7b）和射頻加熱（圖7c）時，峰強度上升，可能的原因是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)舒展，部分發(fā)色基團向外翻轉(zhuǎn)，色氨酸和酪氨酸殘基暴露。同樣的，Sun Cuixia[13]和Tong Ping[29]等的研究表明，熱處理可以增加玉米醇溶蛋白和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的紫外吸收。3 種不同的加熱方式中，水浴加熱峰強度整體下降，射頻和微波加熱峰強度整體上升。究其原因可能是因為熱交換方式不同，水浴加熱以熱傳導為主，射頻和微波則通過電磁場達到熱交換的目的。對于蛋白質(zhì)分子微觀結(jié)構(gòu)，共價鍵、非共價鍵受分子振動摩擦發(fā)生斷裂導致微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這也可以解釋微波加熱時峰強度變化更明顯，相較于射頻處理，微波作用更加劇烈，對分子結(jié)構(gòu)的影響也更大。

2.7 熱處理后玉米醇溶蛋白傅里葉變換紅外光譜分析

通過傅里葉變換紅外光譜可對蛋白結(jié)構(gòu)進行分析，3 600～3 300 cm－1位置的峰強度通?？梢员硎居衩状既艿鞍追肿娱g和分子內(nèi)部氫鍵以及O—H、N—H鍵的伸縮振動強度[30]。如圖8所示，3 600～3 300 cm－1位置的峰強度在70 ℃時先降低后隨著處理溫度升高而逐漸增強，表明熱處理會改變玉米醇溶蛋白的水合能力。此外，位于2 932 cm－1位置的峰變化較小，說明射頻加熱處理沒有對玉米醇溶蛋白分子內(nèi)的C—H鍵產(chǎn)生較大的影響[31]。

圖8 不同熱處理條件加熱玉米醇溶蛋白分散液的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 8 Fourier transform infrared spectra of zein dispersion under different heat treatment conditions

蛋白質(zhì)紅外光譜酰胺I帶（1 700～1 600 cm－1）經(jīng)傅里葉去卷積并轉(zhuǎn)化為二階導數(shù)圖譜可以用來分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)[32]。峰所處位置歸屬的二級結(jié)構(gòu)如下：1 642～1 610 cm－1歸屬為β-折疊；1 650～1 642 cm－1歸屬為無規(guī)卷曲；1 660～1 650 cm－1歸屬為α-螺旋；1 680～1 660 cm－1歸屬為β-轉(zhuǎn)角；1 700～1 680 cm－1歸屬為β-反平行[33]。熱處理前后酰胺I帶二階導數(shù)圖譜及玉米醇溶蛋白二級結(jié)構(gòu)含量分別如圖9和表1所示。3 種處理方式均使玉米醇溶蛋白的無規(guī)卷曲、β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加，但是減少了β-轉(zhuǎn)角和β-反平行結(jié)構(gòu)含量。其中，無規(guī)卷曲、β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加最明顯的是射頻處理，上升范圍分別為6.43%～8.29%和15.19%～19.05%，水浴加熱至70 ℃可使β-轉(zhuǎn)角含量下降26.68%，射頻處理至80 ℃可使β-反平行含量下降32.48%，說明熱處理可有目的地改變玉米醇溶蛋白的二級結(jié)構(gòu)。水浴和射頻處理后的玉米醇溶蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)含量均上升，微波處理至70 ℃時，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量也上升，但加熱至80、90 ℃含量下降，這可能是更強的交變電場強度及溫度同時作用導致的。微波加熱處理蛋白質(zhì)的研究也顯示，在微波加熱過程中麥谷蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生的無規(guī)則變化可能是微波的非熱效應(yīng)導致的[16]。

圖9 不同熱處理及對照酰胺I帶二階導數(shù)譜圖Fig. 9 Deconvoluted infrared spectra of amide I band of native and heat treated zein samples

表1 玉米醇溶蛋白二級結(jié)構(gòu)含量Table1 Secondary structure contents of zein samples

3 結(jié) 論

3 種熱處理方式均能顯著提高玉米醇溶蛋白溶解度、乳化能力和巰基含量，并隨著終點處理溫度的升高而升高。在對蛋白溶解度和巰基含量的測定中，射頻處理影響最大，微波處理次之，水浴處理影響最小。DSC分析表明除微波處理外，蛋白熱穩(wěn)定性基本呈下降趨勢。紫外光譜分析表明，水浴處理使蛋白質(zhì)聚集、基團被包裹，微波和射頻處理使分子結(jié)構(gòu)舒展、基團暴露。傅里葉變換紅外光譜分析表明，熱處理使玉米醇溶蛋白水合能力下降，二級結(jié)構(gòu)由β-折疊、α-螺旋、無規(guī)卷曲向β-轉(zhuǎn)角、β-反平行轉(zhuǎn)變，射頻和微波處理對其的影響更大。