周 密，張 科，汪 軍

（1.蕪湖市公安局，安徽 蕪湖 241000；2.安徽省公安廳物證鑒定管理處，安徽 合肥 230061；3.安徽工程大學(xué)計(jì)算機(jī)與信息學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

近年來，二代測序技術(shù)蓬勃發(fā)展，逐步開始運(yùn)用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。2014年，美國Illumina公司推出了MiSeq FGxTM平臺和ForenSeqTMDNA Signature Prep試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific公司推出了Ion Torrent PGMTM平臺和Precision ID Identity Panel試劑盒。運(yùn)用二代測序技術(shù)，基于一份檢材就可以同時獲得短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入/缺失（insertion/deletion，InDel）、線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）、信使 RNA（messenger RNA，mRNA）等各種類型的大量遺傳標(biāo)記信息。其中SNP被認(rèn)為是第三代遺傳標(biāo)記，在法醫(yī)學(xué)個體識別、表型預(yù)測和始祖研究等方面都有巨大潛力[1]。本研究將對二代測序試劑盒中SNP位點(diǎn)的遺傳學(xué)參數(shù)進(jìn)行對比分析，探討其在個體識別和親子鑒定中的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 基礎(chǔ)數(shù)據(jù)

ForenSeqTMDNA Signature Prep試劑盒包含94個常染色體 SNP位點(diǎn)，Precision ID Identity Panel試劑盒包含90個常染色體SNP位點(diǎn)，兩個試劑盒共有的SNP位點(diǎn)為83個，合計(jì)有101個SNP位點(diǎn)。ForenSeqTMDNA Signature Prep試劑盒獨(dú)有位點(diǎn)11個：rs763869、rs8037429、rs8078417、rs2399332、rs279844、rs2920816、rs1294331、rs13182883、rs1336071、rs2111980、rs4606077。Precision ID Identity Panel試劑盒獨(dú)有位點(diǎn) 7 個：rs1872575、rs2016276、rs2292972、rs4288409、rs560681、rs7520386、rs7704770。

在國際人類基因組單體型圖計(jì)劃網(wǎng)站（http://www.hapmap.org）和美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）上查詢101個SNP位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率、群體調(diào)查樣本量、人群來源等遺傳學(xué)參數(shù)。其中95個位點(diǎn)的數(shù)據(jù)來源于北京漢族人群（CHB）調(diào)查結(jié)果，4個位點(diǎn)的數(shù)據(jù)來源于中國人群（CHN）調(diào)查結(jié)果，2個位點(diǎn)的數(shù)據(jù)來源于北京漢族人群和日本人群（CHB+JPT）調(diào)查結(jié)果，有2個位點(diǎn)僅有等位基因頻率數(shù)據(jù)。

1.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)通常采用χ2檢驗(yàn)來量度常用基因型的預(yù)期值和觀察值之間的吻合程度。公式為：

其中χ2檢驗(yàn)的自由度為：

υ=基因型數(shù)-1。

將每一種基因型的χ2值相加獲得總的χ2值，然后查χ2值表得P值。以P＞0.05作為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的界限[2]。根據(jù)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

1.3 個體識別系統(tǒng)效能

個體識別的系統(tǒng)效能通常用個體識別率（discrimination power，DP）和累積個體識別率（cumulative discrimination power，CDP）來定量評價(jià)，公式[3]為：

式中，Pi代表第i個基因型的頻率，DPi為第i個基因座的DP。

因?yàn)镃DP為1-DP的連乘乘積，所以本研究以1-DP對比遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的系統(tǒng)效能。在北京漢族人群中，根據(jù)公式（2）和（3），計(jì)算 101 個 SNP 位點(diǎn)的DP和平均DP（DPSNP），以及兩個試劑盒的CDP。根據(jù)中國漢族人群的遺傳學(xué)參數(shù)[4]，統(tǒng)計(jì)41個STR基因座的平均 DP（DPSTR）。

設(shè)個體識別中，平均n1個SNP位點(diǎn)等于1個STR基因座的系統(tǒng)效能。以1-DPSNP對比遺傳標(biāo)記系統(tǒng)間的系統(tǒng)效能，則有：

1.4 標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體鑒定系統(tǒng)效能

標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體鑒定的系統(tǒng)效能通常用標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體非父排除率（probability of paternity excluding in trios，PEtrio）和累積非父排除率（probability of exclusion，CPE）來定量評價(jià)，公式為：

式中，Pi、Pj分別代表第 i、j個等位基因的頻率。

因?yàn)镃PE為1-PE的連乘乘積，所以本研究以1-PE對比遺傳標(biāo)記系統(tǒng)的系統(tǒng)效能。在北京漢族人群中，根據(jù)公式（6）和（7），計(jì)算 101 個 SNP 位點(diǎn)的PEtrio和平均 PEtrio（PEtrio-SNP），以及兩個試劑盒的 CPEtrio。根據(jù)中國漢族人群的遺傳學(xué)參數(shù)[4]，統(tǒng)計(jì)41個STR基因座的平均 PEtrio（PEtrio-STR）。

設(shè)標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體鑒定中，平均n2個SNP位點(diǎn)等于1個STR基因座的系統(tǒng)效能。以平均PEtrio對比遺傳標(biāo)記系統(tǒng)間的系統(tǒng)效能，則有：

1.5 二聯(lián)體鑒定系統(tǒng)效能

二聯(lián)體鑒定的系統(tǒng)效能通常用二聯(lián)體非父排除率（probability of paternity excluding in duos，PEduo），公式[3]為：

式中，Pi、Pj分別代表第 i、j個等位基因的頻率。

與三聯(lián)體鑒定同理，在北京漢族人群中，根據(jù)公式（10）和（7），計(jì)算 101 個 SNP 位點(diǎn)的 PEduo和平均PEduo，以及兩個試劑盒的CPEduo。根據(jù)中國漢族人群的遺傳學(xué)參數(shù)[4]，統(tǒng)計(jì)41個STR基因座的平均PEduo。設(shè)二聯(lián)體鑒定中，平均n3個SNP位點(diǎn)等于1個STR基因座的系統(tǒng)效能。同理有：

1.6 雙親皆疑鑒定系統(tǒng)效能

雙親皆疑鑒定的系統(tǒng)效能通常用雙親皆疑排除率（probability of exclusion in alleged parents cases，PEAP）來定量評價(jià)，公式為：

式中，Pi代表第i個等位基因的頻率。與三聯(lián)體鑒定同理，在北京漢族人群中，根據(jù)公式（12）和（7），計(jì)算 101 個 SNP 位點(diǎn)的 PEAP和平均 PEAP（PEAP-SNP），以及兩個試劑盒的CPEAP。根據(jù)中國漢族人群的遺傳學(xué)參數(shù)[4]，統(tǒng)計(jì) 41 個 STR 基因座的平均 PEAP（PEAP-STR）。設(shè)雙親皆疑鑒定中，平均n4個SNP位點(diǎn)等于1個STR基因座的系統(tǒng)效能。同理有：

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

101個SNP位點(diǎn)的等位基因頻率、樣本數(shù)、人群來源、Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)的P值見表1。由表1可見，除無基因型頻率數(shù)據(jù)的rs722098和rs2016276位點(diǎn)外，其余99個SNP位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05）。

表1 101個SNP位點(diǎn)的遺傳學(xué)參數(shù)

表1（續(xù)）

表1（續(xù)）

2.2 個體識別系統(tǒng)效能和對比

101個SNP位點(diǎn)的DP見表1。ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒的 CDP 為 1-1.1521×10-34，Precision ID Identity Panel試劑盒的CDP為1-2.0524×10-33。 1-DPSNP為 0.440 4，1-DPSTR為 0.096 9，n1為2.85。結(jié)果表明，在個體識別中，平均2.85個SNP位點(diǎn)等于1個STR基因座的系統(tǒng)效能。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體鑒定系統(tǒng)效能和對比

101個SNP位點(diǎn)的PEtrio見表1。ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒的 CPEtrio為 1-4.4169×10-8，Precision ID Identity Panel試劑盒的CPEtrio為1-8.7093×10-8。 1-PEtrio-SNP為 0.833 4，1-PEtrio-STR為 0.4394，n2為4.51。結(jié)果表明，在標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體鑒定中，平均4.51個SNP位點(diǎn)等于1個STR基因座的系統(tǒng)效能。

2.4 二聯(lián)體鑒定系統(tǒng)效能和對比

101個SNP位點(diǎn)的PEduo見表1。ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒的 CPEduo為 1-8.4837×10-5，Precision ID Identity Panel試劑盒的CPEduo為1-1.1638×10-4。 1-PEduo-SNP為 0.9030，1-PEduo-STR為 0.607 6，n3為4.88。結(jié)果表明，在二聯(lián)體鑒定中，平均4.88個SNP位點(diǎn)等于1個STR基因座的系統(tǒng)效能。

2.5 雙親皆疑鑒定系統(tǒng)效能和對比

101個SNP位點(diǎn)的PEAP見表1。ForenSeqTMDNA Signature Prep 試劑盒的 CPEAP為 1-1.2227×10-12，Precision ID Identity Panel試劑盒的 CPEAP為 1-3.7257×10-12。 1-PEAP-SNP為 0.7464，1-PEAP-STR為 0.264 1，n4為4.55。結(jié)果表明，在雙親皆疑鑒定中，平均4.55個SNP位點(diǎn)等于1個STR基因座的系統(tǒng)效能。

3 討 論

SNP廣泛存在于人類基因組中的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，平均每721 bp有1個SNP[6]，是目前分布最廣泛、數(shù)量最多的一種遺傳標(biāo)記。SNP的特點(diǎn)有：（1）擴(kuò)增片段極短；（2）大都表現(xiàn)為二等位基因標(biāo)記；（3）突變率約為10-9，遠(yuǎn)低于STR突變率（約10-3）[2]。這些特點(diǎn)決定了SNP在法醫(yī)學(xué)個體識別與親子鑒定領(lǐng)域中具有巨大潛力。遺傳學(xué)參數(shù)是二代測序SNP位點(diǎn)結(jié)果解釋的前提，是二代測序技術(shù)在個體識別和親子鑒定中大規(guī)模應(yīng)用的根本基礎(chǔ)。因此本研究首先查詢并計(jì)算二代測序試劑盒檢測的101個SNP位點(diǎn)的常用遺傳學(xué)參數(shù)，為SNP分型結(jié)果解釋奠定基礎(chǔ)。其次，了解了在法醫(yī)學(xué)個體識別和親子鑒定中，需要檢測多少個SNP位點(diǎn)才能達(dá)到目前STR基因座的檢驗(yàn)水平。本研究進(jìn)一步計(jì)算了個體識別、標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體鑒定、二聯(lián)體鑒定和雙親皆疑鑒定4種最常見的鑒定類型中，SNP位點(diǎn)和STR基因座系統(tǒng)效能換算比例，為今后設(shè)計(jì)二代測序試劑盒的SNP位點(diǎn)提供重要參考。

在整理101個SNP位點(diǎn)群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)的過程中，筆者發(fā)現(xiàn)如下問題：（1）群體調(diào)查樣本量過少，多為41～45人，最少的僅有18人，而STR群體調(diào)查樣本量往往有數(shù)千人；（2）中國漢族人群群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)較少，現(xiàn)有數(shù)據(jù)多為北京漢族人群，有2個位點(diǎn)還混有日本人群；（3）2個位點(diǎn)無基因型頻率，既不能進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，也不能直接計(jì)算DP值。除無基因型頻率數(shù)據(jù)的rs722098和rs2016276位點(diǎn)外，本研究中其他99個SNP位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。只有處于Hardy-Weinberg平衡的群體中獲得的群體數(shù)據(jù)，才能保證其可靠性和準(zhǔn)確性，才能應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)個體識別和親子鑒定。此外，因?yàn)楸狙芯繜o法獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，不能檢驗(yàn)各SNP位點(diǎn)的獨(dú)立性，即連鎖不平衡檢驗(yàn)，而連鎖不平衡檢驗(yàn)是個體識別的累積似然率（cumulative likelihood rate，CLR）和親子鑒定的累積親權(quán)指數(shù)（cumulative paternity index，CPI）計(jì)算的前提?？紤]到群體數(shù)據(jù)的上述不足，筆者認(rèn)為應(yīng)進(jìn)一步對中國漢族人群進(jìn)行較大規(guī)模的SNP位點(diǎn)群體調(diào)查，以獲取更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)進(jìn)行適合性檢驗(yàn)和獨(dú)立性檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)的計(jì)算也將更為精確。

本文兩個二代測序試劑盒分別包含90和94個SNP位點(diǎn)，個體識別系統(tǒng)效能換算后相當(dāng)于32和33個STR基因座，遠(yuǎn)超一代測序；親子鑒定系統(tǒng)效能換算后相當(dāng)于18～21個STR基因座，接近一代測序[4]。在系統(tǒng)效能相當(dāng)?shù)那闆r下，SNP位點(diǎn)具有突變案例數(shù)極低的優(yōu)勢。以二聯(lián)體鑒定為例，檢測20個STR基因座，則平均50個案例出現(xiàn)1例突變，必須考慮突變案例；而檢測100個SNP位點(diǎn)，則平均1 000萬個案例出現(xiàn)1例突變，無需考慮突變案例?？梢姡琒TR突變案例是SNP的20萬倍。此外，如果聯(lián)合應(yīng)用二代測序的SNP位點(diǎn)和STR基因座，充分利用二代測序的超大信息量優(yōu)勢，則祖孫、同胞、半同胞等較遠(yuǎn)親緣關(guān)系的親子鑒定還將有進(jìn)一步發(fā)展。

總之，二代測序SNP分型技術(shù)在法庭科學(xué)中的個體識別和親子鑒定領(lǐng)域展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，具備極大的應(yīng)用價(jià)值，對于公安實(shí)戰(zhàn)也有強(qiáng)大吸引力。但該技術(shù)的大規(guī)模普及仍存在如下挑戰(zhàn)：（1）科學(xué)的結(jié)果解釋。如何將二代測序數(shù)據(jù)結(jié)果轉(zhuǎn)化為鑒定結(jié)論和法庭證據(jù)，有待法醫(yī)DNA概率統(tǒng)計(jì)學(xué)理論的深入研究。（2）二代測序和一代測序數(shù)據(jù)庫的接軌。公安機(jī)關(guān)DNA數(shù)據(jù)庫已超過6000萬條數(shù)據(jù)，而且數(shù)據(jù)量還在高速增長，二代測序結(jié)果勢必要與DNA數(shù)據(jù)庫平滑對接。（3）分析軟件的支持。二代測序信息量極高，數(shù)據(jù)結(jié)果的分析、比對、計(jì)算靠人工幾乎不可能，必須依賴計(jì)算機(jī)軟件。（4）測序成本須有效降低。二代測序基于開放性平臺，開發(fā)國產(chǎn)試劑盒可大幅降低成本。