王 磊 ，王 琪 ，林漢成 ，黃 平 ，鄧愷飛 ，羅儀文 ，孫其然 ，張清華 ，王振原 ，孫俊紅 ，托 婭

（1.上海健康醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201318；2.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；3.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；4.西安市公安局刑事偵查局技術(shù)處，陜西 西安 710038；5.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061）

死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷一直是法醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)[1-2]。近年來，傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）光譜技術(shù)在死亡時間推斷研究中以其快速、準(zhǔn)確和靈敏等特點(diǎn)展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢和潛力[3-4]。本課題組在前期研究中分析了常溫（20℃）下死后大鼠腎組織FTIR光譜變化與死亡時間的關(guān)系[5]，建立了死亡時間推斷方法，但在鑒定實踐中，死亡時間通常會受到溫度、濕度、動物和人為破壞等多因素影響[6-7]，使得應(yīng)用FTIR光譜技術(shù)精確推斷死亡時間面臨挑戰(zhàn)。

本研究結(jié)合FTIR光譜與數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)高準(zhǔn)確率、高敏感性和高穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，對不同溫度下大鼠腎組織光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘（partial least square，PLS）回歸分析，并探討溫度對死亡時間推斷PLS回歸模型性能的影響，以優(yōu)化死亡時間推斷PLS回歸模型性能，提高死亡時間推斷準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 樣本處理和取材

本研究所有動物實驗經(jīng)司法鑒定科學(xué)研究院科學(xué)與倫理委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行。成年健康雄性大鼠30只，體質(zhì)量240～280g（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供），采用頸椎脫臼法處死后，將大鼠尸體分別置于4℃、20℃和30℃環(huán)境中，每個溫度組10只。取大鼠腎皮質(zhì)組織，大小約1 mm×1 mm×1 mm，其中4℃和20℃組大鼠分 別于 處死后 0、6、12、24、48、72、96、120、144 和168 h 取材，30℃組于處死后 0、6、12、24、36、48、60 和72h取材。每只大鼠腎組織樣本重復(fù)收集，即每個時間點(diǎn)收集10個樣本。檢材經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗滌后立即液氮冷凍。

1.2 數(shù)據(jù)采集

取液氮中保存組織置于衰減全反射（attenuated total reflectance，ATR）探頭硒化鋅晶體表面，下壓ATR探頭上的杠桿擠壓大鼠腎組織，使之緊密貼附于晶體表面，用電吹風(fēng)機(jī)（冷風(fēng)）吹干組織。選用Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）采集光譜，掃描范圍 4 000～900cm-1，分辨率4cm-1，每個樣本重復(fù)掃描20次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有光譜數(shù)據(jù)采用Unscrambler?X 10.4（挪威CAMO公司）和MATLAB?R2014a軟件（美國Math Works公司）進(jìn)行歸一化和二階導(dǎo)數(shù)預(yù)處理，然后利用Unscrambler?X 10.4軟件對預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA。每個時間點(diǎn)隨機(jī)選取8個樣本的光譜數(shù)據(jù)建立校正集，其余2個樣本的光譜數(shù)據(jù)建立預(yù)測集，采用留一法交叉驗證建立死亡時間推斷PLS回歸模型。

PLS回歸模型中決定系數(shù)（R2）、校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）以及交叉驗證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）是校正模型的評估參數(shù)；預(yù)測均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）是模型外部驗證參數(shù)，評估模型預(yù)測效果。

2 結(jié) 果

2.1 光譜預(yù)處理

在4 000～900 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)測定大鼠腎組織FTIR圖譜，其中1 800～900 cm-1為光譜信息指紋區(qū)，所以選取該段光譜進(jìn)行研究[10]。所有光譜經(jīng)預(yù)處理后均得到理想的FTIR光譜，圖1為大鼠死后48h腎組織在不同溫度下的平均光譜圖（隨機(jī)選取該時間點(diǎn)進(jìn)行譜圖展示）。

圖1 大鼠死后48h不同溫度下腎組織平均光譜圖

2.2 光譜數(shù)據(jù)PCA結(jié)果

對4℃、20℃和30℃組中各死亡時間點(diǎn)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，部分結(jié)果如圖2所示。三個溫度組中，死后 6 h（圖 2A）、12 h（圖 2B）和 24 h（圖 2C）樣本數(shù)據(jù)大致可以聚為兩類，死后48h（圖2D）和72h（圖2E）樣本數(shù)據(jù)則顯著地聚為三類。在4℃和20℃組中，死后 96 h（圖 2F）、120 h（圖 2G）、144 h（圖 2H）和 168 h（圖2I）樣本數(shù)據(jù)可清晰聚為兩類。

由以上結(jié)果可知，三個溫度下組織光譜差異在死后48h和72h較為明顯。圖3為大鼠死后48h和72 h光譜數(shù)據(jù)PCA主成分1的因子載荷圖，可見主成分 1 的因子載荷于 1640cm-1、1579cm-1、1537cm-1和1 404 cm-1等波數(shù)附近絕對值較高，反映了這些波數(shù)附近的因子（變量）對數(shù)據(jù)PCA樣本聚類趨勢具有較高貢獻(xiàn)。

圖2 三個溫度環(huán)境下各死亡時間點(diǎn)光譜數(shù)據(jù)PCA結(jié)果

圖3 大鼠死后48h和72h光譜數(shù)據(jù)

2.3 溫度對PLS回歸模型的影響

分別利用4℃、20℃和30℃組光譜數(shù)據(jù)建立死亡時間推斷PLS回歸模型。模型結(jié)果如表1所示：4℃組模型交叉驗證R2最低，為0.78，預(yù)測均方根誤差最大，為20.3h；20℃組模型交叉驗證R2最高，為0.95，預(yù)測均方根誤差最小，為12.8h；30℃組模型交叉驗證R2為0.85，交叉驗證均方根誤差為9.3h，但預(yù)測均方根誤差較高，為17.7h。圖4為20℃組光譜數(shù)據(jù)PLS回歸模型（該模型性能最優(yōu)）加權(quán)回歸系數(shù)圖，可見PLS 模型回歸系數(shù)在 1641cm-1、1579cm-1、1537cm-1和1404cm-1等波數(shù)附近絕對值較高。

表1 各溫度組光譜數(shù)據(jù)PLS回歸模型參數(shù)

圖4 20℃組光譜數(shù)據(jù)PLS模型的加權(quán)回歸系數(shù)圖

3 討 論

隨著FTIR光譜技術(shù)及數(shù)據(jù)處理能力的發(fā)展，利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)分析死后生物組織FTIR光譜變化為死亡時間推斷提供了新方法。近年來，有學(xué)者利用死后組織FTIR光譜特征的時序性變化進(jìn)行死亡時間推斷[3，10-11]，但是這些研究忽略了溫度對死后組織變化及其光譜特征的影響。因此，本研究通過分析大鼠死后腎組織在不同環(huán)境溫度下的FTIR光譜特征，建立死亡時間推斷PLS回歸模型，探索溫度對模型性能的影響。

由于大鼠腎皮質(zhì)組織容易發(fā)生自溶，且自溶較快，因此選其作為研究對象。此外，本研究中30℃環(huán)境下大鼠腎皮質(zhì)組織液化較快，72h后不能取到有形固體組織，為避免液化組織和固體組織光譜差異所產(chǎn)生的誤差，30℃環(huán)境下樣本取到死后72h。

在PCA結(jié)果中，4℃、20℃和30℃組光譜數(shù)據(jù)在多個時間點(diǎn)聚類趨勢明顯，體現(xiàn)了三種溫度下大鼠腎組織化學(xué)組分具有一定差異。尤其在死后48h和72h，三個溫度下組織光譜數(shù)據(jù)清晰地聚為三類，為了分析這種趨勢形成的原因，本研究對這兩組光譜數(shù)據(jù)PCA主成分1的因子載荷進(jìn)行分析。主成分因子載荷絕對值反映了數(shù)據(jù)變量對PCA樣本聚類（分類）趨勢的貢獻(xiàn)，因子載荷絕對值越大則變量貢獻(xiàn)度越高。結(jié)果顯示：主成分 1 載荷因子在 1640cm-1、1579cm-1、1537cm-1和1404cm-1等波數(shù)附近絕對值較高，在1200～900cm-1范圍內(nèi)普遍較低。根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]報道：1 640 cm-1和1 537cm-1附近分別是酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ結(jié)構(gòu)蛋白吸收峰；1404cm-1和1579cm-1附近分別是對稱和非對稱COO-吸收峰，源于氨基酸和脂肪酸；1200～900cm-1范圍內(nèi)以糖類等碳水化合物吸收峰為主。該結(jié)果與文獻(xiàn)報道[5，11-12]結(jié)果一致，表明在 4℃、20℃和 30℃環(huán)境下，大鼠腎組織光譜差異主要是由組織中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸等物質(zhì)組分的變化引起，而糖類等碳水化合物特征對PCA貢獻(xiàn)值較低。

關(guān)于組織分解過程，有研究[13-15]發(fā)現(xiàn)，機(jī)體死亡數(shù)分鐘后組織中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等物質(zhì)在自身釋放的酶作用下開始分解。DAVIDO等[16]研究了15℃、22℃和29℃環(huán)境下死后大鼠組織分解情況，發(fā)現(xiàn)溫度越高其體內(nèi)酶活性越高，尸體體質(zhì)量損失越快，掩蓋尸體土壤中的碳量與微生物呼吸作用產(chǎn)生的碳量增長越快。關(guān)于RNA的分解，有研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，隨死亡時間延長，不同環(huán)境溫度下RNA完整性和含量變化完全不同：低溫［（4±2）℃］環(huán)境中 RNA 含量較高，且完整性較好；高溫環(huán)境［（25±2）℃、（35±2）℃］中 RNA含量和完整性降低。說明由于不同溫度下死后組織內(nèi)酶的活性，以及微生物繁殖演替速度和種類的不同，使組織中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等組分的分解出現(xiàn)明顯差異。

PLS是非常有效的數(shù)據(jù)挖掘工具，被廣泛應(yīng)用于食品、化工和生物等領(lǐng)域[19-20]。近來有法醫(yī)學(xué)者利用PLS算法分析死后組織FTIR光譜數(shù)據(jù)并建立了死亡時間推斷PLS回歸模型[10-11]，為死亡時間推斷提供了新的鑒定方法和研究思路，但是這些研究未考慮環(huán)境溫度等因素對組織的影響。VASCONCELOS等[21]通過分析不同溫度下腐敗雞肉的FTIR光譜，發(fā)現(xiàn)不同溫度（3℃、8℃和30℃）下雞肉組織光譜數(shù)據(jù)的PLS回歸模型性能差異較大。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)不同溫度組光譜數(shù)據(jù)PLS回歸模型性能不同。首先，PLS回歸模型交叉驗證R2是最能體現(xiàn)模型擬合度的參數(shù)，其中 4℃組 R2最低，為 0.78，20℃組 R2最高，為 0.95；其次，4℃組PLS回歸模型誤差在三個溫度組中最大；最后，需要注意的是，30℃組模型預(yù)測均方根誤差（17.7h）遠(yuǎn)高于交叉驗證均方根誤差（9.3h），而 20℃組預(yù)測均方根誤差和交叉驗證均方根誤差相近，說明20℃組模型穩(wěn)定性更好。綜上可以認(rèn)為，本研究中20℃組PLS回歸模型性能最優(yōu)，推測30℃和4℃環(huán)境下死后大鼠腎組織FTIR光譜特征變化規(guī)律可能較20℃組更為復(fù)雜，因此在后續(xù)利用組織FTIR光譜數(shù)據(jù)建立死亡時間推斷PLS回歸模型時有必要考慮尸體環(huán)境溫度因素。

在PLS回歸分析中，加權(quán)回歸系數(shù)絕對值反映了變量對PLS回歸的貢獻(xiàn)度。對于20℃組PLS模型加權(quán)回歸系數(shù)在 1641cm-1（酰胺Ⅰ）、1579cm-1（非對稱COO-）、1537cm-1（酰胺Ⅱ）和 1404cm-1（對稱 COO-）等波數(shù)附近絕對值較高，即這些變量對PLS回歸分析貢獻(xiàn)較大，結(jié)果和主成分1因子載荷值基本一致，說明不同溫度下死后大鼠腎組織光譜變化主要與大鼠腎組織中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸等物質(zhì)組分的變化有關(guān)。

本研究借助計算機(jī)軟件和數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)解析FTIR光譜信息，分析不同溫度下大鼠腎組織光譜特征差異，建立死亡時間推斷PLS回歸模型，并比較不同溫度組PLS回歸模型性能。但是，目前關(guān)于溫度與尸體分解關(guān)系的系統(tǒng)性研究相對較少，本研究主要參照各領(lǐng)域關(guān)于不同環(huán)境溫度下組織分解的研究[14-15，21]，以及法醫(yī)學(xué)鑒定實踐中常見的低溫（4℃左右）、常溫（20℃左右）和高溫（30℃左右）尸體環(huán)境，選取了具有代表性的三個溫度組作為初步研究目標(biāo)，發(fā)現(xiàn)不同溫度下各死亡時間點(diǎn)光譜特征變化具有一定的規(guī)律。但在鑒定實踐中，尸體周圍環(huán)境更加復(fù)雜多變，需要在后續(xù)研究中增加人工控制溫度、土壤特性以及環(huán)境濕度等影響因素[22]，以獲取更全面的數(shù)據(jù)，結(jié)合先進(jìn)的紅外光譜及數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)建立可靠的數(shù)學(xué)模型，提高死亡時間推斷的準(zhǔn)確性。