張慧敏，鞠玲燕，徐成鋼，王靜，李兆杰，劉玉敏，崔鳳杰，崔嘉

（威海出入境檢驗檢疫局，山東威海264205）

我國GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[1]中明確規(guī)定食品中允許添加的色素種類，如天然色素和部分水溶性的合成色素。工業(yè)色素是能使其他物質(zhì)獲得鮮明而堅實顏色的有機(jī)物，通常顯色亮麗，不易褪色，所以一般用來對油漆、鞋油、汽油、汽車、玩具等用品增光[2-3]，在食品中嚴(yán)禁使用，例如橙色Ⅱ?qū)儆谝患壷掳┪?，酸性間胺黃成人誤服0.25 g就可中毒，其違法性質(zhì)和量刑巨大[4-5]。工業(yè)色素按照官能團(tuán)可以分為以下幾類：中性色素、酸性色素、堿性色素等[6]。為防止一些不法分子節(jié)約成本，在食品中添加工業(yè)色素，給人民身心健康帶來嚴(yán)重危害，有必要建立高靈敏、準(zhǔn)確、快速的篩查檢測方法。

食品中工業(yè)色素的檢測方法多采用液相色譜法[5-9]和液質(zhì)聯(lián)用法[10-13]，前處理方法和檢測的工業(yè)色素種類不盡相同，對于中性色素和堿性色素的報道較多，酸性色素的研究較少，而且多集中于液相色譜檢測方法[6-7]。目前尚未見采用高分辨質(zhì)譜測定辣椒粉中酸性色素的報道，靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜是在FullMS/ddMS2模式下同時進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描和數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描，其以母離子作為定量離子，簡化了質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，節(jié)省了樣品分析前的準(zhǔn)備工作，更利于樣品的快速篩查和定量分析。并且靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜具備基于數(shù)據(jù)庫的多種未知物的篩查功能，較普通串聯(lián)質(zhì)譜分辨率更高，適用于對食品中多種有害物進(jìn)行快速篩查的發(fā)展方向[14-15]。

本研究選擇7種較為常見的酸性色素作為研究對象，以辣椒粉為基質(zhì)，建立超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法對7種酸性色素進(jìn)行快速篩查和定量。方法采用Q-Exactive的正負(fù)離子切換模式獲得一級數(shù)據(jù)，通過提取目標(biāo)化合物的一級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)獲得定性和定量結(jié)果，通過自動觸發(fā)獲得的二級全掃描數(shù)據(jù)進(jìn)一步提高定性的準(zhǔn)確性。該方法快捷、方便、高通量，可用于辣椒粉中7種酸性色素的快速篩查和確證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（Q-Exactive）：美國 ThermoFisher公司；高速離心機(jī)（CR22GⅡ）：日立公司；超聲波提取儀（SB5200）：必能信超聲（上海）有限公司。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為酸性紫紅B（acid carmoisine B）、酸性黑Ⅰ（acid clack 1）、橙色Ⅰ（orange 1）、橙色Ⅱ（orange 2）、酸性深藍(lán) P-2RB（acid blue 113）、酸性間胺黃（metanil yellow）、羅丹明 110（rhodanmine 110）：德國Dr.Ehrenstorfer公司，稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇∶水（1∶1，體積比）配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的儲備液，于4℃下避光保存，使用時逐級稀釋。

甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國默克公司；乙酸銨（分析純）：萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；辣椒粉：當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 色譜質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；流動相：A為乙腈，B為10 mmol/L乙酸銨水溶液。梯度洗脫程序：0～2 min，15%A；2 min～2.1 min，15%A～40%A；2.1 min～8.1 min，40%A～80%A；8.1 min～9 min，80%A；9 min～10 min，15%A。分析時間：10 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

噴霧電壓：正離子模式3.5 kV，負(fù)離子模式2.8 kV；離子源溫度：300℃；傳輸金屬毛細(xì)管溫度：350℃；鞘氣壓力：35 kPa；輔助氣壓力：15 kPa；掃描范圍（m/z）：150 Da～750 Da；一級質(zhì)譜全掃描（Full scan）分辨率：R=70 000；自動增益控制進(jìn)入軌道阱中的離子數(shù)：3e6；最大注入時間：100 ms；數(shù)據(jù)依賴二級離子全掃描分辨率：R=17 500；歸一化碰撞能設(shè)為40 eV，在此基礎(chǔ)上加減 50%；2e5；最大注入時間：50 ms；動態(tài)排除：10 s。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品于20 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL甲醇∶水（1∶1，體積比），渦旋，超聲輔助提取10 min，8 000 r/min 離心 5 min，取上清液過 0.45 μm 濾膜，上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

研究考察了甲醇、水、甲醇∶水（1∶1，體積比）3種溶劑的提取效果，如圖1所示。

發(fā)現(xiàn)甲醇、水、甲醇∶水（1∶1，體積比）對大部分酸性色素的提取效率大致相當(dāng)，但是甲醇∶水（1∶1，體積比）混合液對羅丹明110提取效率明顯優(yōu)于水，因此，選擇甲醇∶水（1∶1，體積比）混合液作為提取液。

2.2 流動相的優(yōu)化

在流動相的選擇中，發(fā)現(xiàn)橙色Ⅰ和橙色Ⅱ的分子式相同，均為C16H11N2O4SNa，但是結(jié)構(gòu)不同，而且在提取精確質(zhì)量數(shù)327.044 50時出現(xiàn)兩個色譜峰，互為同分異構(gòu)體。本研究通過優(yōu)化流動相，對比乙腈-水、甲醇-水、10 mmol/L乙酸銨-甲醇、10 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動相對待測物色譜分離的影響，如圖2所示。

10 mmol/L乙酸銨-乙腈做流動相時各化合物的信號相應(yīng)較高，而且可以實現(xiàn)橙色Ⅰ和橙色Ⅱ基線分離，通過比較這兩種化合物的保留時間可以將二者有效區(qū)分。

圖1 不同提取試劑對7種酸性色素提取效率的影響Fig.1 Effect of different reagents on extraction efficiencies of 7 acid dyes

2.3 色譜柱的優(yōu)化

考察 ACQUITY UPLC@BEN C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） 超高效色譜柱、ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）超高效色譜柱和普通的C18色譜柱對待測物的分析效果。結(jié)果表明，在相同流動相的前提下，ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）能夠提供更好的分離效果。本試驗選擇ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）作為色譜柱。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究采用高分辨質(zhì)譜的一級質(zhì)譜全掃描加數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜掃描方式，通過全掃描確定7種酸性色素的保留時間，對目標(biāo)檢測物進(jìn)行定性篩查和確證。使用高分辨質(zhì)譜檢測目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù)對于同時準(zhǔn)確定性和定量非常重要，因此必須保證質(zhì)譜數(shù)據(jù)具有良好的質(zhì)量準(zhǔn)確度，如表1所示。

7種酸性色素的質(zhì)量準(zhǔn)確度誤差均小于2 μg/kg，可見檢測物的質(zhì)量準(zhǔn)確度均很好，可以滿足定性需求。

高分辨質(zhì)譜最大的優(yōu)勢是通過高分辨率消除樣品中的基質(zhì)干擾，提高定性和定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一級全掃描采用分辨率R=70 000，所有待測物可與基質(zhì)中干擾物實現(xiàn)基線分離。根據(jù)獲得的精確質(zhì)量數(shù)設(shè)定目標(biāo)物列表，僅在一級質(zhì)譜掃描時發(fā)現(xiàn)列表中的母離子，且其強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閥值時，可自動采集二級質(zhì)譜掃描。碰撞能量設(shè)為40 eV，并在此基礎(chǔ)上加減50%，即有3個碰撞能量對目標(biāo)物進(jìn)行碰撞，最終加和獲得豐富的碎片離子。歐盟EC 2002/657號文件對多級質(zhì)譜確證時的碎片類型和識別點有明確規(guī)定，禁用物質(zhì)確證須有4個識別點，在高分辨質(zhì)譜中，母離子的識別點為2.0，子離子的識別點為2.5，因此只需一個母離子和一個子離子即可對目標(biāo)物確證[16]。通過7種酸性色素的二級質(zhì)譜全掃描獲得碎片離子信息，提高定性的準(zhǔn)確性，如圖3和表1所示。

表1 7種酸性色素的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、相對質(zhì)量偏差及碎片離子信息Table1 Accurate masses，retention time，relative mass deviations and fragment ions of 7 acid dyes

圖3 7種酸性色素的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of 7 acid dyes

2.5 線性關(guān)系和檢出限

本研究以母離子作為定量離子，采用外標(biāo)法定量。用不含待測物的空白基質(zhì)溶液配置一系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，經(jīng)高分辨質(zhì)譜測定，以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對照溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用基質(zhì)空白溶液逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至儀器所能檢出的最低濃度確定為檢出限（limit of detection，LOD），如表2所示。

表2 7種酸性色素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table2 Linear regression equations，correlation coefficients，linear ranges and LODs of 7 acid dyes

7種酸性色素在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，可滿足檢測要求。

2.6 回收率及精密度

選取辣椒粉為空白樣品，分別添加3個不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.3方法進(jìn)行前處理，每個水平重復(fù)測定6次，計算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果表明，7種酸性色素測定的平均回收率為78.6%～105.3%，RSD為3.5%～6.3%。該方法具有較好的回收率和重復(fù)性，可以滿足辣椒粉中7種酸性色素日常檢測要求。

2.7 實際樣品的檢測

用本方法對10份辣椒粉樣品進(jìn)行測定，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)酸性色素的陽性樣品。

3 結(jié)論

本研究利用高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，建立快速定性篩查和定量分析辣椒粉中7種酸性色素的方法。方法采用高分辨率質(zhì)譜進(jìn)行分析，高分辨質(zhì)譜的高分辨率可以有效清除辣椒粉的基質(zhì)干擾效應(yīng)，同時利用數(shù)據(jù)依賴的二級質(zhì)譜全掃描獲得豐富的碎片離子，可以對定性結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，提高了篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性，大大降低了假陽性出現(xiàn)的幾率。該方法快速、準(zhǔn)確，覆蓋多種酸性色素，可用于辣椒粉中酸性色素的快速檢測。