賈 欣

（山西省食品工業(yè)研究所，山西太原 030024）

黑豆屬于豆科植物種子，又稱為黑大豆、馬料豆、烏豆等。我國(guó)黑豆資源十分豐富，在全國(guó)各地的種植面積較高。黑豆味甘性平，有祛風(fēng)除熱、保腎健脾、明目之功效；黑豆所含亞油酸能防止血清中膽固醇的增加和沉積，對(duì)防治高血壓和心血管疾病有重要作用；黑豆中的異黃酮、皂甙等能調(diào)節(jié)鈣質(zhì)代謝，防止骨質(zhì)疏松，還可調(diào)節(jié)激素效應(yīng)，降低婦女更年期綜合癥狀；黑豆具有顯著的抗氧化、延緩衰老、強(qiáng)化免疫、保護(hù)心血管及抗腫瘤等功能；黑豆皮色素結(jié)構(gòu)中的鄰位二酚羥基可螯合金屬離子，減少金屬離子對(duì)氧化反應(yīng)的催化作用，是一種重要的天然食用色素和食品添加劑。因此，加大對(duì)黑豆的深入研究，實(shí)現(xiàn)黑豆類食品的工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)人們的身體健康和我國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)原料

黑豆，臨汾柴村產(chǎn)青仁小黑豆。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電子天平，上海天達(dá)儀器有限公司；GZX-9246數(shù)顯鼓風(fēng)干燥器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；U V-1100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；LS Y電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；R J-TDL-40 低速大容量臺(tái)式離心機(jī)，無(wú)錫瑞江分析儀器有限公司；P HS-3TC數(shù)密數(shù)顯酸度計(jì)，上海天達(dá)儀器有限公司；R e-52真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試劑及藥品

無(wú)水乙醇、36%～38%鹽酸、沒(méi)食子酸、福林-酚試劑、無(wú)水碳酸鈉、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 黑豆皮原料粉的制備

將黑豆洗凈，在室溫下用蒸餾水浸泡24 h，人工去皮，將黑豆皮在40℃條件下恒溫干燥24 h后，用植物粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，即得到黑豆皮粉末。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取黑豆皮醇提取物的影響

準(zhǔn)確稱取1 g黑豆皮粉末5份，分別以100mL體積分?jǐn)?shù)0%、20%、40%、60%、80%的乙醇為提取劑，在60℃，pH為1的條件下提取1 h，抽濾除去固體殘?jiān)?，減壓蒸發(fā)水浴回流，得到黑豆皮醇提取物粉末。

2.2.2 pH對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

準(zhǔn)確稱取1 g黑豆皮粉末5份，100mL體積分?jǐn)?shù) 60%乙醇為提取劑，調(diào) pH為 1、2、3、4、5，60℃下提取1 h，抽濾除去固體殘?jiān)?，減壓蒸發(fā)水浴回流，得到黑豆皮醇提取物粉末。

2.2.3 提取溫度對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

準(zhǔn)確稱取1 g黑豆皮粉末4份，100mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇為提取劑，調(diào)pH為1，分別于20℃、40℃、60℃、80℃下提取1 h，抽濾除去固體殘?jiān)?，減壓蒸發(fā)水浴回流，得到黑豆皮醇提取物粉末。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)提取黑豆皮醇提取物的影響

準(zhǔn)確稱取1 g黑豆皮粉末6份，100mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇為提取劑，調(diào)pH為1，分別置于70℃條件下提取0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后，抽濾除去固體殘?jiān)?，減壓蒸發(fā)水浴回流，得到黑豆皮醇提取物粉末。

2.2.5 料液比對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

準(zhǔn)確稱取1 g黑豆皮粉末5份，分別以25mL、50mL、100mL、150mL、200mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇為提取劑，調(diào)pH為1，70℃提取1 h，抽濾除去固體殘?jiān)?，減壓蒸發(fā)水浴回流，得到黑豆皮醇提取物粉末。

2.3 星點(diǎn)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇每個(gè)單因素的最佳條件設(shè)計(jì)三因素五水平的星點(diǎn)試驗(yàn)，根據(jù)Design Expert7.0軟件設(shè)計(jì)星點(diǎn)試驗(yàn)，建立二次三元旋轉(zhuǎn)回歸方程，優(yōu)化提取黑豆皮醇提取物的工藝參數(shù)。

2.4 黑豆皮醇提取物中多酚和黃酮含量的確定

準(zhǔn)確稱取10 g黑豆皮粉末，在研究所得的最佳提取工藝參數(shù)下提取黑豆皮醇提取物，減壓蒸發(fā)水浴回流一定時(shí)間蒸干后，得黑豆皮醇提取物粉末。用無(wú)水乙醇復(fù)溶，過(guò)濾，最后定容至20mL，使樣品最終濃度為0.5 g/mL。樣品保存在棕色瓶中，備用。

3 結(jié)果分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑豆皮醇提取物的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

由圖1可知，在pH值為1，料液比為1：100，溫度為60℃，提取時(shí)間為1 h的條件下，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于60%時(shí)，粗提物隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，粗提物達(dá)到最大值，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，粗提物呈下降趨勢(shì)。綜合各種因素，選取體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇為此單因素試驗(yàn)的最佳提取溶劑。

3.1.2 pH對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

pH對(duì)黑豆皮醇提取物的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 pH對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

由圖2可知，在60℃，料液比為1：100時(shí)，用不同pH值的60%乙醇提取1 h，隨著pH的不斷增大，粗提物逐漸減小，且pH從1增加到4 h，粗提物急速下降。這可能是因?yàn)閜H過(guò)大影響了粗提物的溶解性，并有可能破壞了粗提取物中化學(xué)物質(zhì)的活性。

3.1.3 提取溫度對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

提取溫度對(duì)黑豆皮醇提取物的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

由圖3可知，在pH值為1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1：100，提取時(shí)間為1 h時(shí)，隨著溫度的升高，提取出的粗提物呈上升趨勢(shì)。由于乙醇的沸點(diǎn)為70℃～80℃，綜合各種因素，此單因素試驗(yàn)選擇70℃為最佳提取溫度。

3.1.4 提取時(shí)間對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

提取時(shí)間對(duì)黑豆皮醇提取物的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，在pH值為1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1：100，70℃條件下提取，隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取出的粗提物呈弱增長(zhǎng)趨勢(shì)，增長(zhǎng)趨勢(shì)不顯著。綜合考慮，選取1 h為最佳提取時(shí)間。

3.1.5 料液比對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

料液比對(duì)黑豆皮醇提取物的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 提取時(shí)間對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

圖5 料液比對(duì)黑豆皮醇提取物的影響

由圖5可知，在pH值為1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，70℃提取1 h的條件下，隨料液比的增大，粗提物逐漸增大，且當(dāng)料液比從1：25增大到1：100時(shí)，粗提物增長(zhǎng)較快；當(dāng)料液比從1：100增大到1：200時(shí)，粗提物增長(zhǎng)緩慢。在料液比為1：200時(shí)粗提物達(dá)到最大，但是提取液體積過(guò)大會(huì)加大操作難度及增加藥品的用量，且粗提物和1：100時(shí)相比沒(méi)有顯著的變化。綜合考慮，此單因素試驗(yàn)選取1：100為最佳料液比。

3.2 星點(diǎn)試驗(yàn)分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 星點(diǎn)試驗(yàn)分析方案

根據(jù)各條件下的單因素試驗(yàn)，以提取溫度、pH值和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)應(yīng)3個(gè)獨(dú)立變量A、B、C，并以-1.68，-1，0，1，1.68分別代表變量的水平，用Design Expert7.0軟件進(jìn)行編碼分析和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)結(jié)果如表1所示。

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

3.2.2 試驗(yàn)結(jié)果分析

利用Design Expert7.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可得二次三元回歸模型：Y=+31.71+0.76A-0.11B+1.39C+0.056AB+0.39AC-0.26BC-0.71A2-0.55B2－0.69C2。

表2 回歸模型方差分析表

由表2數(shù)據(jù)可知，模型P=0.013 1＜0.05，表明二次三元回歸模型極其顯著；失擬項(xiàng)P=0.065 7＞0.05，模型失擬度不顯著。故該模型擬合程度好，可以用此模型對(duì)黑豆皮醇提取物進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

3.2.3 兩因素交互作用的響應(yīng)面分析

兩因素交互作用的響應(yīng)面分析結(jié)果分別見(jiàn)圖6、圖7、圖8。

圖6 提取溫度和pH對(duì)黑豆皮醇提取物提取率的響應(yīng)面圖(a)與等高線圖(b)

圖7 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑豆皮醇提取物的響應(yīng)面圖(a)與等高線圖(b)

由圖6、圖7、圖8的響應(yīng)面分析可知，黑豆皮醇提取工藝的最佳條件組合：提取溫度為67.930℃，提取pH為1.7，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，理論上黑豆皮醇提取物提取率可達(dá)32.925 mg/g，實(shí)際上測(cè)得黑豆皮醇提取物提取率為32.148mg/g，存在誤差2.36%。在實(shí)際生產(chǎn)中為了生產(chǎn)方便選擇提取溫度為70℃，提取pH為2，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，此時(shí)黑豆皮醇提取物提取率為31.424mg/g，與理論貼近度為95.44%。

圖8 pH和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黑豆皮醇提取物的響應(yīng)面圖(a)與等高線圖(b)

3 討論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究了提取溫度、提取pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)及其交互作用對(duì)黑豆皮醇提取物提取率的影響。目前統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)已廣泛應(yīng)用于食品生物等領(lǐng)域的優(yōu)化研究。傳統(tǒng)的單因素法在研究過(guò)程中存在明顯不足。試驗(yàn)過(guò)程不僅費(fèi)時(shí)，而且忽略了不同因子之間的交互作用，不能準(zhǔn)確得到多個(gè)影響因子的最佳組合；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)雖然彌補(bǔ)了單因素試驗(yàn)法的不足，能夠做到同時(shí)考慮多種因素并找出最佳的因素水平組合，但不能得到在整個(gè)區(qū)域內(nèi)多因素的最佳組合和相應(yīng)值的最優(yōu)值之間的明確關(guān)系；而響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以做到通過(guò)少量試驗(yàn)次數(shù)既能確定多個(gè)影響因素中的關(guān)鍵因素，確定其最佳組合及響應(yīng)值的最優(yōu)值，從而在研究中得到廣泛的應(yīng)用。

我國(guó)是黑豆的主要栽培國(guó)家之一，黑豆皮中含大量花青素，是天然色素的重要來(lái)源之一；黑豆皮中含有黃酮類物質(zhì)，黃酮類化合物具有很強(qiáng)的抗氧化能力。黑豆皮的原料豐富，醇提取物操作簡(jiǎn)單，價(jià)格經(jīng)濟(jì)，可開(kāi)發(fā)為高效的天然抗氧化劑的新資源，以期在醫(yī)藥、食品等行業(yè)得到廣泛推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)確定黑豆皮醇提取物的最佳提取工藝參數(shù)為：提取pH1.7，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1：100，提取溫度67.930℃，提取時(shí)間1 h，理論上黑豆皮醇提取物的提取率可達(dá)32.925mg/g，實(shí)際測(cè)得提取物為32.148mg/g，存在誤差2.36%。在實(shí)際生產(chǎn)中為了生產(chǎn)方便選擇提取溫度為70℃，提取pH為2，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1：100，提取時(shí)間為1 h，此時(shí)黑豆皮醇提取物的提取率為31.424mg/g，與理論貼近度為95.44%。