褚晨艷顏?zhàn)映客?緣劉 言楊 瀾陳 軍（

1蘇州世標(biāo)檢測技術(shù)有限公司，河南鄭州215104） （2淮陰工學(xué)院，江蘇淮安223003）

隨著淡水魚產(chǎn)量的增加和淡水魚加工制品的日益開發(fā)和生產(chǎn)，大量的淡水魚加工廢棄物有待處理。近年來除了對(duì)魚頭、魚尾等利用較多外，蛋白質(zhì)和脂肪含量較高的內(nèi)臟卻沒有得到合理有效的利用，這不僅造成了資源的浪費(fèi)，而且污染了環(huán)境。魚內(nèi)臟中脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸及礦物質(zhì)含量豐富。利用魚內(nèi)臟來開發(fā)淡水魚油、動(dòng)物飼料蛋白強(qiáng)化劑的前景廣闊。淡水魚內(nèi)臟蛋白的氨基酸組成模式比較平衡，魚蛋白量大而質(zhì)優(yōu)，有著巨大的開發(fā)潛力，是蛋白生產(chǎn)的良好來源。因此，對(duì)淡水魚下腳料資源—魚內(nèi)臟綜合利用的研究具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚內(nèi)臟。

胰蛋白酶、牛血清蛋白、鹽酸、氫氧化鈉、硼酸、硫酸、考馬斯亮藍(lán)、氯化鈉、硫酸鉀、硫酸銅、甲基紅、亞甲基藍(lán)、無水乙醇等。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；電熱恒溫培養(yǎng)箱；電熱恒溫水浴鍋；精密酸度計(jì)；離心機(jī)（Anke）；電子式可調(diào)萬用電爐；分光光度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 草魚內(nèi)臟蛋白水解工藝流程

草魚內(nèi)臟→去雜→洗凈→瀝干→勻漿→脫脂→烘干→酶解→離心

1.3.2 草魚內(nèi)臟主要成分分析方法

蛋白質(zhì)含量：凱氏（Micro-kjeldahl）定氮法。

粗脂肪：索氏提取法（Soxhlet extractor method）。

氨基態(tài)氮測定：考馬斯亮藍(lán)法（coomassie blue staining）。

1.3.3 草魚內(nèi)臟蛋白水解單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取經(jīng)脫脂烘干的內(nèi)臟于三角瓶中，加入胰蛋白酶液進(jìn)行酶解，將酶解液3 000 r/min離心30 min，測定上清液中蛋白含量，計(jì)算水解度（DH）。分別以酶解溫度、加酶量、酶解時(shí)間、pH、液料比為變量做單因素試驗(yàn)，每組試驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.3.4 草魚內(nèi)臟蛋白水解正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇3個(gè)重要的影響因素為自變量，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，以水解度為指標(biāo)，研究草魚內(nèi)臟蛋白水解過程中各個(gè)因素對(duì)水解效果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚內(nèi)臟基本成分分析

草魚內(nèi)臟基本成分表見表1。

表1 草魚內(nèi)臟基本成分表

不同季節(jié)草魚內(nèi)臟中的脂肪和蛋白質(zhì)含量有所差異，但總體變化不大。由表1可知，草魚內(nèi)臟中的脂肪含量很高。試驗(yàn)結(jié)果顯示，草魚內(nèi)臟中含有大量粗脂肪和粗蛋白，分別達(dá)25.81%和6.99%。

干燥脫脂后草魚內(nèi)臟的蛋白含量為62.68%，考馬斯亮藍(lán)比色法和凱氏定氮法測定結(jié)果的比值即水解度。

2.2 草魚內(nèi)臟蛋白水解的單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶解溫度對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解度的影響

草魚內(nèi)臟蛋白在不同溫度下水解，溫度對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解度的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶解溫度對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解度的影響

由圖1可知，當(dāng)溫度為30℃時(shí)，其酶解液水解度25.13%；當(dāng)酶解溫度上升至35℃時(shí)，水解度呈現(xiàn)上升的趨勢，并達(dá)到最大值；當(dāng)超過35℃以后，水解度曲線呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。因此選擇最佳的酶解溫度為35℃。

2.2.2 酶添加量對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解度的影響

酶添加量對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解度的影響結(jié)果見圖2。

由圖2可知，加酶量較低時(shí)草魚內(nèi)臟蛋白水解度較低，隨著加酶量的增加水解度也逐漸增大，當(dāng)加酶量達(dá)到25U/mL時(shí)，水解度達(dá)到最大值，再增加酶量，水解度增加趨勢不明顯。這是因?yàn)楫?dāng)酶濃度相對(duì)于底物濃度較高的情況下，反應(yīng)速率開始由底物濃度控制，所以繼續(xù)增加酶的用量，水解度的變化不明顯。為了使魚內(nèi)臟蛋白水解較徹底，適當(dāng)控制水解出的蛋白含量，因此，加酶量選25U/mL。

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解的影響

酶解時(shí)間對(duì)草魚內(nèi)臟蛋白酶解液水解度的影響如圖3所示。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解度的影響

酶的催化速度受到產(chǎn)物的影響，反應(yīng)初期，產(chǎn)物的抑制作用小，隨著時(shí)間的延長，產(chǎn)物的抑制作用增加，酶活力逐漸下降。由圖3可知，酶解時(shí)間為1 h時(shí)，水解度較低，此時(shí)反應(yīng)不完全，底物未能夠被完全水解；當(dāng)酶解時(shí)間延長至3 h時(shí)，水解度達(dá)到最高值，為35.99%；當(dāng)酶解時(shí)間超過3 h后，產(chǎn)物的抑制作用增加，水解度呈下降趨勢，但與3 h時(shí)的水解度相比還是保持在較高水平。

2.2.4 pH值對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解的影響

酶活力對(duì)其環(huán)境pH值十分敏感，只有在特定的pH值條件下，酶分子與底物蛋白分子才會(huì)結(jié)合更快更好，酶解速度也較快。pH對(duì)草魚內(nèi)臟蛋白酶解液的水解度影響如圖4所示。

圖4 pH值對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解度的影響

由圖4可知，當(dāng)pH為3時(shí)，水解度較小，為15.57%；pH為4、5、6時(shí)，水解度呈上升趨勢，這說明胰蛋白酶在酸性條件下活性較低；當(dāng)pH為7時(shí)，草魚內(nèi)臟蛋白酶解液水解度最高，此時(shí)胰蛋白酶活性最高。因此，選擇pH值為7較為合適。

2.2.5 液料比對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解的影響

液料比對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解度的影響結(jié)果見圖5。

圖5 液料比值對(duì)水解蛋白含量影響

由圖5可知，當(dāng)液料比較小時(shí)，草魚內(nèi)臟蛋白酶解液水解出的蛋白含量較低，這是由于底物濃度過大，胰蛋白酶不能與底物充分接觸，從而使其不能充分反應(yīng)，增加液料比，底物濃度降低，酶解液水解出的蛋白含量增加，當(dāng)液料比增加到40時(shí)，水解度達(dá)到最大為36.87%，繼續(xù)增加液料比，水解度不再增加甚至變小，因?yàn)榈孜餄舛冗^低，酶無法與底物充分結(jié)合，影響其水解，隨著產(chǎn)物的抑制作用逐漸增強(qiáng)，水解度會(huì)變得更低。因此，選擇40為最佳液料比。

2.3 草魚內(nèi)臟蛋白的水解正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，時(shí)間和液料比對(duì)魚內(nèi)臟蛋白水解度的影響不大，因此選取酶添加量、水解溫度、pH值3個(gè)因素，采用L9（33）正交試驗(yàn)對(duì)草魚內(nèi)臟蛋白水解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)和結(jié)果分別見表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)

表3 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析

由分析結(jié)果可以看出，溫度對(duì)于水解度的影響最為顯著，pH值對(duì)水解度的影響較小，采用軟件對(duì)上述測定指標(biāo)分析，得出酶解最優(yōu)條件為：酶解溫度35℃，酶添加量25 U/mL，酶解pH8.0，液料比40，酶解時(shí)間3 h，草魚內(nèi)臟蛋白酶解液的水解效果最好，可被水解的蛋白占魚內(nèi)臟總蛋白的37.87%。

3 存在及待解決的問題

本試驗(yàn)中，草魚內(nèi)臟蛋白的最優(yōu)水解度僅為37.87%，還有提高的可能性，并且由于內(nèi)臟前期較難處理，損失較大，且內(nèi)臟中會(huì)滯留一定的腸道內(nèi)容物，它會(huì)抑制酶的活性，影響蛋白質(zhì)的水解，因此如果要提高草魚內(nèi)臟蛋白的水解度，前期處理非常重要，要將腸道內(nèi)容物盡可能地處理干凈，并盡力減小損失，使處理后的內(nèi)臟樣品符合其原有的比例，還要將內(nèi)臟樣品盡量粉碎徹底，使得在反應(yīng)時(shí)底物與酶可以充分并均勻的接觸。本試驗(yàn)過程中沒能很好地解決魚腸道內(nèi)容物的處理問題，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果稍有偏差。因此對(duì)草魚內(nèi)臟蛋白的水解工藝研究還可以進(jìn)一步完善，對(duì)所得水解產(chǎn)物的分析及利用還有待于進(jìn)一步研究。